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产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究 农业等领域，具有普遍的生物学活性及可观的经济效益3-7。 海产品加工产生的虾壳、蟹壳等下脚料是富含几丁质的废弃物，这些未经处理的下脚料，不仅造成资源奢侈，而且污染环境。采纳几丁质酶水解处理，不仅可以有效处理废弃物爱护环境，而且还可以变废为宝，生产高附加值的壳寡糖等系列产品。 自从Benecke首次报道分别到几丁质酶产生菌以来，发觉在微生物中许多细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶8，9。本试验从土壤中筛选出一株产几丁质酶的菌株，经16S rDNA测序，对该菌进行鉴定，并对其酶活和酶学性质进行了测定，为酶法降解几丁质制备几丁寡糖以及该酶在其他领域的应用供应理论和实践的指导。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样 采自武汉设计工程学院校内竹林处、污水处理池旁边和汤逊湖边表层510 cm土壤以及埋有虾壳30 d土壤，分别出产几丁质酶的菌株。 1.1.2 培育基 富集培育基：蛋白胨 1 g、酵母膏1 g、NaCl 0.5 g；初筛平板固体分别培育基：蛋白胨1 g、酵母膏1 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂15 g、3%胶体几丁质80 mL；发酵培育基：蛋白栋0.5 g、酵母膏0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、3%胶体几丁质80 mL；蟹壳发酵培育基：蛋白胨0.5 g、酵母粉0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蟹壳20 g。 1.1.3 胶体几丁质的制备 片状几丁质5.0 g、浓磷酸40 mL置于50 mL小烧杯中，用保鲜膜将杯口封好，28 放置24 h。24 h后取出，5 000 r/min离心10 min，取上清液，加NaOH和去离子水调pH至7.0， 5 000 r/min离心10 min，取沉淀即为胶体几丁质。 1.2 方法 1.2.1 产酶菌种筛选 将待测样品加无菌生理盐水并用玻璃珠打散，静置2 min后取上清液加入富集培育基中，在37 恒温摇床上培育24 h。将富集后的菌液稀释成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8系列稀释菌液，分别匀称涂布在初筛平板固体分别培育基中，放入37 的恒温培育箱中培育36 h，然后用0.1%刚果红染色2030 min，再用1 mol/L NaCl脱色1015 min，选择能产生透亮圈的单菌落。 1.2.2 酶活的测定 取出初筛得到的菌株，接种至液体发酵培育基中，置于37 的恒温摇床上振荡培育48 h后，测定发酵液的酶活。1 mL酶液在37 、pH 7.0的条件下每分钟产生相当于l mol N-乙酰氨基葡萄糖还原糖所需的酶量定义为单位酶活。几丁质酶酶活的测定方法10如下：取5 mL摇瓶培育液经5 000 r/min离心10 min；取0.5 mL上清液，加入1 mL Mcllvaine缓冲液、0.5 mL 3%胶体几丁质，于37 水浴30 min，然后沸水浴10 min，取1 mL 4 000 r/min离心5 min，加0.5 mL DNS试剂终止反应；沸水浴5 min立即冷却，加入4 mL去离子水后测OD540 nm；以N-乙酰葡萄糖含量为横坐标，光密度OD为纵坐标绘制标准曲线，用空白管作零点。 1.2.3 酶学性质的测定 1）pH对酶活性的影响。以0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L柠檬酸配制pH 3.08.0梯度缓冲液，以0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L Gly配制pH 8.510.0梯度缓冲液，根据上述标准方法测定酶活，依据不同pH缓冲液的吸光值，测定酶的最适反应pH。 2）温度对酶活性的影响。以最适pH缓冲液配制溶度为3%胶体几丁质底物，根据标准曲线测定方法测定在不同温度下的酶活。确定酶反应的最适温度。 3）酶的pH稳定性。各取1 mL酶液于pH 3.010.0的缓冲液中4 放置12 h。以最适pH缓冲液配制3%胶体几丁质底物测定活性，以未用缓冲液处理的酶液的酶活为101%，计算相对酶活。 4）酶的热稳定性。在确定酶的最适pH的前提下，以氢氧化钠、甘氨酸为底物缓冲溶液调整pH为最适pH，各取1 mL的原酶液放入3080 的水浴锅中保温30 min，然后再加入最适pH配制的3%胶体几丁质的底物，在最适温度下测定酶活，以未处理的酶液的酶活为101%，计算相对酶活。 1.2.4 菌株降解蟹壳实力的测定 取蟹壳发酵培育基50 mL分装至250 mL的锥形瓶中，按1%接种量接种后置于37 摇床振荡培育，以未接种的培育基作为空白比照，测定培育15 d后发酵上清液的还原糖。 1.2.5 产酶菌株的初步鉴定 采纳菌体干脆扩增16S rDNA的方法11。PCR扩增引物选用16S rDNA细菌通用引物27f/1492r。反应体系：25 mmol/L MgCl2 5 L，10×Buffer 2.5 L，25 mmol/L dNTP 2 L，上下游引物各1 L，模板DNA 1 L，Taq酶 0.25 L，ddH2O 12.25 L，总体系为25 L。PCR反应条件：94 2 min，94 30 s，52 30 s， 73 1 min，共30个循环。PCR产物采纳试剂盒纯化后送至深圳华大基因科技有限公司进行测序，将测序结果同GenBank数据库的基因序列进行比对，以确定该菌类型。 2 结果与分析 2.1 产酶菌株的筛选 将富集培育的细菌经过梯度稀释后接种到筛选培育基上，筛选出7株可以产透亮圈的菌株分别命名为1、2、3、4、5、6、7。测定7株菌的菌落直径以及透亮圈直径和菌落直径比，结果如表1所示，1号菌的透亮圈与菌落直径比较大。在几丁质平板上，菌落四周形成的透亮圈除与菌株产酶水平相关外，还与菌株分泌的几丁质内切酶与外切酶比例相关，所以不能仅以菌落四周透亮圈大小推断菌株的产酶实力，筛选时必需综合考虑透亮圈大小、光明程度、菌落大小以及菌落下培育基的液化程度12。因此，对所选取的7株含有透亮圈的菌株进行复筛，从中选出目的菌株。 2.2 酶活测定 2.2.1 标准曲线制作 测定不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度，绘制标准曲线如图1所示。从标准曲线可以看出，NAG的含量和吸光度呈线性关系，回来方程为y=1.936 9x-0.040 0，R2=0.1013 8，式中，x为葡萄糖含量，y为OD540。 2.2.2 发酵液粗酶活 对选择的7株含有透亮圈的菌株放入发酵培育基中培育，取上清液，利用标准曲线的测定方法测定吸光值，通过计算得到的酶活如图2所示。由表1、图2可以看出，4号菌株的透亮圈与菌落直径比较2、5、6号菌株透亮圈与菌落直径比大，而其酶活却较之小，由此可知，透亮圈与菌落直径比与酶活力的凹凸并非呈正相关。通过酶活的测定得到1号菌株的吸光值最大，表明在相同时间内，该菌株产生的酶活最大。因此选用1号菌株作为目的菌株。 2.3 酶学性质测定 2.3.1 pH对酶活性质的影响 将1号菌株放在不同pH梯度下，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度。所测结果如图3所示，随着pH上升，酶活力不断上升，在pH 7.5以后起先下降。在pH 7.58.0时酶的活性较高，在pH 7.5时最高，所以该酶最适pH为7.5。该酶在pH7.5活性起先下降，pH为10时仍有较高的活性，说明该菌耐碱性实力较强，在中性和碱性条件下更简单产生几丁质酶。 2.3.2 温度对酶活的影响 将pH固定在最适pH 7.5，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度，绘制不同温度下的酶活曲线。结果如图4所示，该酶在2060 时活性特别高，但在30 时最高，所以该酶最适温度为30 。该酶60 活力下降很快，在73 以后活力微小。该几丁质酶的最适反应温度为30 ，略高于蜂房芽孢杆菌产生的酶，低于黄杆菌产生的酶，据报道蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度为28 3，黄杆菌的最适酶活温度为50 2。 2.3.3 酶的pH稳定性 酶液在不同pH缓冲液中4 保存12 h后，测得残余酶活，绘制相对酶活曲线。由图5可知，pH 6.59.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.08.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下特别稳定。 2.3.4 酶的热稳定性 在最适pH条件下，通过标准曲线的测定方法，测定不同温度下保存30 min后的酶活，绘制不同温度下的相对酶活曲线。由图6可知，该酶在低于60 的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。 2.4 产酶菌株的初步鉴定 将16S rDNA的测序结果通过Blast软件与GenBank数据库比对，发觉该序列与芽孢杆菌属同源性最高，达到101%，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。 2.5 菌株降解蟹壳的实力 取1 mL发酵液上清液与DNS反应，依据标准曲线计算得出，每瓶发酵液总还原糖为5.3 mg，即该菌降解1 g蟹壳产生5.3 mg还原糖。表明该菌株可以干脆降解蟹壳，但降解效果不是很好。 3 小结与探讨 通过平板透亮圈法初筛、复筛，从土壤中获得一株透亮圈最大的1号菌株，依据菌株和菌落的形态以及革兰氏染色，初步鉴定该菌株为紫色短杆菌，经过16S rDNA的测序，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。 本试验中所探讨的细菌产几丁质酶的最适pH为7.5，略高于蜂房芽孢杆菌和黄杆菌，蜂房芽孢杆菌产的酶的最适pH为6.89，黄杆菌产的酶的最适pH为7.02。该几丁质酶的最适反应温度为30 ，略高于蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度28 9，而低于黄杆菌的最适酶活温度50 2。 酶是一种活性蛋白，因此酶的稳定性在探讨酶的过程中起重要作用，而温度和pH是影响酶稳定性的两个主要因素。本探讨中，几丁质酶在pH 6.59.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.08.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下特别稳定；同时该酶在低于60 的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。众所周知，蟹壳中几丁质的含量很高，但是目前未见有利用菌干脆降解蟹壳的报道。本探讨首次将筛选的菌干脆用于降解蟹壳，结果表明，该菌具有降解蟹壳的实力，但是效果不是很好。缘由可能是蟹壳没有经过任何处理，结构紧密不适合干脆降解，或者培育条件不合适，没有达到最佳降解条件，还有待于进一步的探讨。 参考文献： 1 杨 革，陈洪章，李佐虎.金龟子绿僵菌深层培育产几丁质酶的探讨J.高校化学工程学报，2022，19：362-367. 2 陈三凤，李季伦.黄杆菌几丁质酶的纯化和性质J.微生物学报，11014，34：14-19. 3 曹 俊，周南进.壳聚糖抗肿瘤作用的探讨进展J.中国生化药物杂志，2022，26：126-127. 4 CHEN A S，TAGUCHI T，SAKAI K，et al. 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