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p53-EGFP表达载体的构建及其对A549的影响 摘 要：构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体，并验证其对肺癌细胞A549的影响。以质粒pcDNA3.1-p53为模板，设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53，将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上，用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，双酶切以及测序验证。将克隆好的载体，利用脂质体法转染A549细胞，荧光显微镜下视察，同时用MTT法测不同时间段细胞OD值。结果表明，琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因扩增胜利。双酶切及DNA测序结果均证明，胜利构建了载体pcDNA3.1-EGFP-p53。转染A549细胞后，荧光显微镜下视察到绿色荧光。MTT法测定结果表明，目的基因转染的A549细胞组所测得的OD值明显低于比照组。因此，具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体pcDNA3.1-EGFP-p53构建胜利，转染A549细胞后，对A549细胞具有肯定抑制作用。为后续接着探讨p53-MDM2 生物发光能量共振转移作用奠定了基础。 关键词：EGFP;抑癌基因;p53;表达载体;A549细胞 中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1018-045701-0001-05 国际DOI编码：10.15958/ki.sdnyswxb.2022.01.001 肿瘤被作为多基因疾病，假如限制细胞分化的基因发生缺陷或变异，就会导致生长调整的失控，加上一连串的变异，包括失去修补基因错误的功能以及逃离监控错误的机制，形成失去秩序的组织等1，这些基因可为肿瘤基因，也可为肿瘤抑制基因。探讨发觉，与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因是p53基因，超过50%的癌症发生与其相关2，因其编码一种分子质量大约为53KDa的蛋白质而得名，在DNA转录、细胞生长和增殖以及很多代谢过程中有重要作用，能够有效地对抗组织增生，促进细胞凋亡，具有维持基因组稳定、抑制或阻挡细胞转化的功能，从而抑制肿瘤的发生3。 p53位于人体17号染色体上，包含了11个外显子和10个内含子，序列长度大约为20 kb4，它编码的p53蛋白含有393个氨基酸残基，即被1182 bp基因序列编码合成。张兆新等5利用EGFP荧光报告表达载体构建了BRET模型，从而筛选出抑制p53-MDM2结合的小分子化合物，为治疗肿瘤找寻了可能。本文通过将p53抑癌基因克隆至含EGFP的荧光报告基因表达载体上，并将其转染至肺癌细胞A549中，视察其是否荧光表达及其对A549细胞的影响，为后续探讨p53-MDM2互作BRET模型，筛选出具有抗肿瘤作用的小分子抑制剂奠定了重要基础。 1 材料与方法 1.1 质粒、菌株和细胞 pcDNA3.1-p53、pcDNA3.1-EGFP质粒以及大肠杆菌Dh5 均由本试验保存。肺癌细胞 A549购于中国昆明细胞库，细胞培育液为添加了10%胎牛血清、1%青链霉素混合液以及1%谷氨酰胺的RPIM1640 培育基。 1.2 主要试剂 DNA限制性内切酶、DNA连接酶购自Takara公司;DNA胶回收试剂盒购自四川成都福际生物有限公司;质粒小提取试剂盒购于天根生物;去内毒素养粒中提试剂盒购自OMEGA;LipofectamineTM 3000转染试剂、Taq DNA聚合酶、dNTP购自Takara公司;RIPM1640培育基购自Gibico公司。其余试剂均为国产分析纯。 1.3 主要仪器 PCR扩增仪、稳压电泳仪及电泳槽;超低温高速离心机;CO2 培育箱;倒置荧光显微镜;微波炉;多功能酶标仪;超净工作台等。 1.4 引物设计与合成 依据NCBI中p53基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，5端分别添加Hind 和BamH酶切位点，由上海英骏公司合成。 上游引物：5-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT 下游引物：5-CGCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG 。 1.5 pcDNA3.1-EGFP-p53表达载体构建 获得目的基因：利用质粒小提取試剂盒对含pcDNA3.1-p53菌液进行质粒提取，以此质粒作为PCR扩增模板。扩增体系为：模板DNA10 M，上下游引物各2 L，2×Phanta Max Master Mix 25 L，ddH2O补至50 L;反应程序：95预变性30 s;95变性15 s，63退火15 s，73延长60 s，34次循环;73彻底延长5 min，终止反应。 基因克隆：胶回收纯化PCR产物，用Takara快切酶进行双酶切，再次胶回，得到最终连接所需目的基因产物，并将其克隆到载体pcDNA3.1-EGFP上。根据以下体系进行连接反应：10×ligation buffer 2 L，载体DNA 50 ng，目的基因p53，T4 DNA Ligase1 L，灭菌水补至20 L，4过夜反应，取部分连接液进行转化。挑取单菌落进行液体培育基扩大培育后菌落PCR和提取质粒双酶切验证，得到阳性克隆菌液送至上海英骏公司进行测序。 1.6 利用脂质体法将pcDNA3.1-EGFP-p53质粒转染A549细胞 采纳LipofectamineTM 3000法转染真核细胞A549，该方法避开了后续细胞培育须要更换无血清培育基。按试剂盒操作说明书进行，转染前用胰酶消化细胞，用适量完全培育基按2.5×105个细胞/孔的密度平铺于6孔板，置于含有5%CO237的细胞培育箱中进行培育，待细胞至73%90%汇合度时转染。将6孔板分为三组，分别是空白比照组、阴性比照组、试验组。转染完成后24 h起先在荧光显微镜下视察各组荧光状况6。 1.7 MTT法检测pcDNA3.1-EGFP-p53质粒转染A549细胞12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，73 h后的影响 复苏培育A549细胞，保持细胞状态良好;接种细胞5×104个/孔密度于24孔板中，每孔加入400 L，按上面的方法分为三个试验组，至73%90%汇合度时转染;参照LipofectamineTM 3000操作说明和要求进行转染试验;分别在转染12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，73 h后，每孔加入50 LMTT溶液，接着培育4h后，在显微镜下视察到结晶体，弃掉上清液，加入400 L DMSO溶液;37摇床上缓慢摇10 min，待晶体溶解;试验组和比照组每孔分三个，分装到96孔板的小孔里，运用酶标仪，在490 nm 处检测吸光度6。 1.8 统计学处理 采纳 SPSS 22.0 软件进行处理。计量资料均用均数±标准差表示。两样本均数比较采纳t 检验，多个样本均数比较采纳单因素方差分析，检验水准：P <0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。 2 结果与分析 2.1 p53基因的PCR扩增与鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑取的3个单菌落做菌落PCR均在约1200 bp处出现特异性条带，与预期大小大小一样，初步说明目的基因已连接到目的载体上且转化胜利。 2.2 重组载体pcDNA3.1-EGFP-p53的双酶切鉴定 经过双酶切表明，出现1182 bp和超过2000 bp两条条带，与预期目的片段大小一样，进一步表明此重组载体构建胜利，将阳性质粒送公司测序后经NCBI BLAST后，结果为目的片段。 2.3 质粒pcDNA3.1-EGFP和质粒pcDNA3.1-EGFP-p53转染A549细胞后荧光显微镜下不同时间段视察结果 转染后，能清楚的视察到比照组有明显的绿色荧光产生，说明空载体转染胜利。与比照组相比，试验组绿色荧光相对较弱，通过视察荧光，检测p53基因是否胜利转入A549细胞，还能视察到不同时间段p53對A549细胞增殖的作用。在24 h起先出现微弱绿色荧光，可能由于转染时间较短造成。在36 h起先荧光强度渐渐增加，其中48 h时达到了最强，后又渐渐变弱，由此可以说明目的质粒转染胜利。 2.4 MTT法测pcDNA3.1-EGFP-p53转染A549细胞后不同时间段OD值改变 转染pcDNA3.1-EGFP-p53质粒的细胞株和比照组的OD值改变表明：获得性表达外源p53基因的A549细胞，从24 h起先，其生长速度明显低于转染含EGFP空载体比照组，其生长明显受到抑制。转染的空载体和含p53基因目的质粒从24 h起先检测起，均与空白细胞组呈显著性差异。 3 结论与探讨 本试验以肺癌细胞A549作为探讨对象，胜利构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体，通过荧光显微镜视察到，在转染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-p53的A549细胞中均可视察到绿色荧光。但由于构建的目的载体中抑癌基因p53位于EGFP上游，所以pcDNA3.1-EGFP-p53的荧光比pcDNA3.1-EGFP的荧光弱。通过MTT法测得不同时间段p53对肺癌细胞A549的影响，与比照组相比，初步说明p53对A549具有肯定抑制作用。为后续深化探讨找寻激活p53小分子化合物构建p53-MDM2互作BRET模型奠定了基础。 p53与EGFP融合表达，作为目前荧光报告基因探讨的热点7，可以通过荧光视察推断目的基因是否表达，无需损伤细胞即可探讨细胞内事务增加型绿色荧光蛋白作为应用最多的发光蛋白，510 nm处左右自行放射绿色荧光，无需协助因子和底物，适于基因转录动力学探讨和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性探讨。绿色荧光的激发波长为蓝光波长，因此可用蓝光波长激发绿色荧光，视察其表达状况。 癌症是当今世界严峻威逼人类生活水平和人类健康的主要缘由之一，也是困扰了人们多年的生物学和医学难题8。探讨发觉，p53作为限制爱护细胞恶性转移主要通路的肿瘤抑制因子，具有抑制或阻挡细胞增殖和转化、维持基因组稳定的功能;mdm2 是 p53 的主要调整因子，其表达产物 MDM2 蛋白可与 p53蛋白结合而抑制 p53 的正常生物学功能，从而诱导肿瘤的发生和发展。目前以探讨p53-MDM2作为癌症治疗的一个新靶点，胡纯琦1、李翔9等课题组利用此靶点进行了小分子抑制剂的筛选，其主要运用的是荧光偏振作用筛选。本课题为了更好找寻抑制p53-MDM2结合的小分子试剂，提出了构建p53-MDM2互作的BRET模型10-14，其中p53-EGFP融合表达是关键一步，为后续高效筛选小分子化合物供应了基础。 参 考 文 献： 1 胡纯琦.p53-MDM2结合抑制剂的设计、合成及生物学活性评价D.杭州：浙江高校，2022. 2 李洪斌.Slug对P53-MDM2系统的调控作用D.天津：河北工业高校，2022. 3 王 炎，李 琦，范忠泽，等.丹参酮A介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡J.世界华人消化杂志，2022，17：124-129. 4 Vogelstein B，Lane D，Levine A J.Surfing the p53 networkJ.Nature，2000，408：307-310. 5 张兆新.p53-mdm2相互作用小分子抑制剂的筛选D.上海：华东师范高校，2022. 6 宝梅英.在A549细胞中重组表达具有EGFP标签的抑癌因子LKB1及对细胞生长和p53蛋白水平的影响D.呼和浩特：内蒙古高校，2022. 7 郭学双.含双荧光报告基因的转基因载体的应用D.苏州：苏州高校，2022. 8 De P M，Venneri M A，Roca C，et al.Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cellsJ.Nature Medicine，2022，9：789-795. 9 李 翔.1.p53-MDM2/MDMX相互作用抑制劑的设计、合成与表征2.新型糖基化多肽的合成、表征及抗体制备D.上海：其次军医高校，2022. 10 Hübner G M，Larsen J N，Guerra B，et al.Evidence for aggregation of protein kinase CK2 in the cell：a novel strategy for studying CK2 holoenzyme interaction by BRET 2J.Molecular Cellular Biochemistry，2022，3101：285. 11 郭晓令，余榕捷，钟佳萍，等.荧光互补与光能量共振转移检测B类G蛋白偶联受体PAC1二聚化J.中国细胞生物报，2022，34：1023-1029. 12 杜 辉，白 波，陈 京.BRET技术在G蛋白偶联受体与-arrestins相互作用探讨中的应用进展J.其次军医高校学报，2022，32：1140-1143. 13 李雅林，白 波，陈 京.生物发光共振能量转移技术及其应用J.中国生物化学与分子生物学报，2022，25：1077-1082. 14 Le N C H，Gel M，Zhu Y，et al.Real-time，continuous detection of maltose using bioluminescence resonance energy transfer on a microfluidic systemJ.Biosensors Bioelectronics，2022，62：177-181. 第10页 共10页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页