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食品仪器分析技术食品仪器分析技术 目 录绪 论项目一 紫外-可见吸收光谱法及其在食品分析中的应用项目二 红外吸收光谱法及其在食品分析中的应用项目三 原子吸收光谱法及其在食品分析中的应用项目四 电位分析法及其在食品分析中的应用项目五 气相色谱法及其在食品分析中的应用项目六 高效液相色谱法及其在食品分析中的应用项目七 质谱法及其在食品分析中的应用绪 论一、食品分析检验的目的与任务 食品分析检验就是研究各类食品组成成分的检测方法、检验技术及有关理论的一门技术性和应用性学科。 食品分析检验的任务是依据物理、化学、生物化学等学科的基本理论和国家食品卫生标准，运用现代科学技术和分析手段，对各类食品工（包括原料、半成品和中间过程、终产品和货架商品）的主要成分和含量进行检测，以保证生产出的产品质量合格。 随着现代分析技术和食品工业的发展，人们不断地发现新的微量组分、污染物和使用新型添加剂以及开发各种功能性食品的研发，食品分析检测的内容越来越多且更加复杂，对定性的可靠性和定量的检侧限以及分析速度的要求也愈来愈苛刻。面对这些挑战，常规分析检验方法往往无能为力，而仪器分析技术则日益显示出在食品分析中的优势和主导地位。 当前，食品分析检验在保障测定灵敏、准确的前提下，正朝着简易、快速、微量、可同时测量若干成分的自动化仪器分析检验方向发展。 仪器分析用于试样组分的分析有操作简便、快速的特点，特别是对于含量低（如质量分数为10-8或10-9数量级）的组分的测定，能取得另人满意的结果。 仪器分析的对象一般是半微量(0.010.1g)、微量(0.110mg)、超微量(0.1g)组分的分析，准确度高。二、食品仪器分析法及其特点 仪器分析法是以物质的物理或物理化学性质为基础而建立起来的一种分析方法，利用较特殊的仪器，对物质进行定性分析，定量分析，形态分析等。它包括光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法等等。 大多数分析仪器是将被测组分的浓度变化或物理性质变化转变成某种电性能（如电阻、电位、电容、电流等）的变化，因此仪器分析法容易实现自动化和智能化，使人们摆脱传统实验室的手工操作。仪器分析除了能完成定性、定量分析任务外，还能进行物质的结构、组分价态等诸多信息的分析。 仪器分析法的局限性。 仪器分析法的准确度不够高，通常相对误差在百分之几左右，有的甚至更大。这样的准确度固然对低含量组分的分析己能完全满足要求，但对常量组分就不能达到象化学分析法所具有的那样高的准确度，因此，在选择方法时，必须考虑这一点。 此外，进行仪器分析之前，需要用化学方法对试样进行预处理（如富集、除去干扰物质等）。同时，进行仪器分析一般都要用标准物质进行定量工作曲线校准，而很多标准物质却需要用化学分析法进行准确含量的测定。 正如著名分析化学家梁树权先生所说“化学分析和仪器分析同是分析化学两大支柱，两者唇齿相依，相辅相成，彼此相得益彰”。三、食品仪器分析方法的选择 首先选择国家、行业或部门规定的标准分析方法； 选择分析结果达到所要求的准确度和精密度的方法； 要根据样品的特性要求正确选择最适宜的分析方法； 必须全面地综合考虑食品检验实验室条件和测量设备，选择合适的分析方法； 在满足分析所要求的准确度和精密度前提下，应尽量选择简单、快捷的分析方法，以有效地节约费用降低检验成本。四、仪器分析方法的有效性（一）精密度、准确度及灵敏度 1、精密度 精密度是指多次平行测定结果相互接近的程度。它代表着测定方法的稳定性和重现性。这些测定结果之间的差异是由偶然误差造成的。常用相对标准偏差（RSD）来表示，也称变异系数（CV）。 %100XSRSD%100XSRSD式中： -n次平行测定结果的算术平均值； S-n次平行测定结果的标准偏差 d1,d2,dn发别为第1次、第2次、第n次测定结果的绝对偏差。%100XSRSD1nd1ndddS2i2n2221 平均值测得值）绝对偏差（dX 2、准确度 准确度指测定值与真实值的接近程度。准确度主要由系统误差来决定的，反映测定结果的可靠性。 某一分析方法的准确度，常用加标回收率来衡量。即在相同条件下用同种方法对加标样品（加入已知量标准物质的样品）和未知样品（未加标准物质的样品）进行预处理和上机测定，按下列公式计算出加标回收率：%100%01mxxP）（式中：P-加标回收率； m-加入标准物质的量； x1-加标样品的测定值；x0-未知样品的测定值。 3、灵敏度 灵敏度是指分析方法所能检测到的最低限量。 提高方法灵敏度的主要方式有： 选择合适的分析方法，不同的分析方法，它的灵敏度是有区别的。这是由于他们的测定原理和仪器结构不同所造成的。可以根据不同的测定组分及其不同的含量来选择合适的分析方法。 优化实验条件，对于某一特定的分析方法，必然有一些实验条件影响待测组分的分析测定。只有在最优化的实验条件下，该分析方法的灵敏度才会最高。 减小空白值。 增大进样量。 富集待测组分，使用合适的浓缩富集方法对样品中待测组分进行分离、浓缩，从而提高分析方法的灵敏度。（二）对照物验证 确定分析方法有效性的最常用方法就是将分析方法用于对照物的分析，考察其结果是否与对照物的标准数据一致。对照物一般指标准参照物或对照试样来源于权威机构，且应有标准对照物合格证。我国提供标准参照物或对照试样的机构主要有国家标准物质研究中心和中国药品生物制品检定所。（三）法定标准方法 检验方法是指对食品进行检测的具体方式或方法，检验规程是指对食品进行检测的具体操作流程或程序。 利用标准的分析方法，利用统一的技术手段才能使分析结果具有权威性，便于比较与鉴别产品的质量，为食品生产和流通领域进行标准化管理，为国际贸易往来和国际经济技术合作有关的质量管理和质量标准提供统一的技术依据。 我国现有的关于食品分析的标准方法主要有食品卫生检验方法理化标准汇编 GB/T5009系列（2008版），以及进出口行业标准、农业标准、水产标准、地方标准等中的有关分析方法。The End食品仪器分析技术食品仪器分析技术 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 【知识目标】1、掌握物质的吸收光谱曲线和光吸收定律；2、认知紫外-可见分光光度计的基本结构和各部件的作用；3、熟悉紫外-可见吸收光谱法的实验技术，包括溶剂的选 择、显色条件的选择、干扰的消除及测定条件的选择等；4、熟悉紫外-可见吸收光谱法的定性定量方法；5、了解紫外-可见吸收光谱法在食品分析中的原理及实验技 术。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用【技能目标】1、能正确使用紫外-可见分光光度计以及相关玻璃仪器；2、熟悉紫外-可见分光光度计的日常维护与保养；3、能正确配制标准溶液、绘制吸收曲线和工作曲线；4、能根据待测样品和实验室现有条件进行最佳实验条件的选 择，如显色剂用量、酸度、显色时间、干扰消除以及仪器 测定条件的选择；5、能正确进行数据记录和处理；6、能对食品项目进行定性和定量测定。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 一、光的基本特性（一）光的波粒二象性 光的本质是电磁辐射，光的基本特性是波粒二象性。波动性和粒子性的关系可表示为： 电磁波频率越大，波长越小，能量就越大。 电磁波按频率（或波长）可分为多种波段。 图1-1 部分电磁波波谱ChhE项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（二）光的存在和相互作用 单色光，既单一频率（或波长）的光。不发生色散。 复合光，多种单色光混合而成的光称为复合光。 可见光是电磁波谱中人眼可以感知的部分。可见光的光波波长范围在400780nm之间,波长小于400nm 的紫外线或波长大于780nm 的红外线均不能被人的眼睹感觉出。如图1-2所示列出了各种色光的近似波长范围。图1-2 色光的近似波长范围 实验证明，将两种适当颜色的光按照一定的强度比例混合，可以成为白光，那么这两种色光就称为互补色光。 图中处于对顶关系的两种颜色的光即为互补色光。例如黄色光和蓝色光互补，绿色光与红紫色光互补，橙色光与青色光互补等等。图1-3 互补色光示意图项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用二、物质对光的选择性吸收 化合物之所以能呈现出各种各样绚丽多彩的颜色，最根本的原因是不同物质分子内部结构不同，分子结构中的电子能够对可见光发生选择性吸收，且化合物能够反射和透射某些波长的光。 当一束白光通过某透明溶液时，如果该溶液对可见光区各波长的光都不吸收，即入射光全部通过溶液，这时看到的这溶液是透明无色的。当该溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，此时看到的溶液呈黑色。若某溶液选择性地吸收了可见光区某波长的光，则该溶液即呈现出被吸收光的互补色光的颜色。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意 例如：当一束白光通过KMnO4溶液时，该溶液中的离子或分子选择性地吸收了500560nm的绿色光，而将其他的色光两两互补成白光而通过，只剩下红紫色光未被互补，所以KMnO4溶液呈现紫红色。 同样道理，K2CrO4溶液对可见光中的蓝色光有最大吸收，所以溶液呈蓝色的互补色光黄色。 可见物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果，而物质呈现的颜色则是被物质吸收光的互补色。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 三、物质的吸收光谱曲线 以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度。然后以入射光的不同波长为横坐标，各相应的吸光度为纵坐标作图，可得到溶液的吸收光谱曲线（简称吸收曲线） 。 吸收光谱曲线是物质的特征性曲线，它和分子结构有严格的对应关系故可作为定性分析的依据。不同的物质，分子的结构不同，其吸收光谱曲线也有其特殊形状。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 在吸收曲线上有一高峰（称为吸收峰）。 光吸收程度最大处所对应的波长称为最大吸收波长（常以max表示）。在进行光度测定时，通常都是选取在max的波长处来测量，因为这时可得到最大的测量灵敏度。 不同物质的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可利用吸收曲线作为物质初步定性的依据。 不同浓度的溶液，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，所不同的是吸收峰峰高随浓度的增加而增高。图1-5 单色光通过盛有溶液的吸收池示意图四、光吸收定律 光吸收定律是紫外-可见分光光度法的理论依据，又称朗伯-比尔定律。 当用一适当波长的单色光照射均匀透明的溶液时，设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则： rtaIIII0taIII0 由于反射光强度很弱，其影响很小，上式可简化为：项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （一）透光度和吸光度 透光度，又称透射比或透光率，为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示，即 当入射光全部吸收时，It=0，T=0；当入射光全部透过时，It=I0，所以0T1。0IITt项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 吸光度，表示光束通过溶液时被吸收的程度，为透光度倒数的对数，用A表示， 当入射光全部被吸收时，It=0，A=；当入射光全部透过时，It=I0 ，A=0，所以0A。T1lgIIlgAt0 （二）朗伯-比耳定律 光被透明介质吸收的比例正比于光程中吸收光的分子的数目，而与入射光强度无关，这就是朗伯-比耳定律，是紫外-可见分光光度法进行定量分析的理论基础。用数学公式表示为： 式中，K为吸光系数，与入射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因素有关。 朗伯-比耳定律表明：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。 KbcTIIAt1lglg0项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 朗伯-比耳定律应用的条件：一是必须使用单色光；二是吸收发生在均匀的介质中；三是吸收过程吸光物质相互不发生作用。 必须指出的是：朗伯-比尔定律只能在一定浓度范围内才适用。因为浓度过高或过低，溶质会发生电离或聚合而产生误差。 朗伯-比耳定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。 （三）吸光系数 朗伯-比耳定律的数学表达式中K称为吸光系数，其物理意义是：单位浓度的溶液，液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位不同而异。 1、摩尔吸光系数 当浓度以物质的量浓度(mol/L)表示，液层厚度以厘米(cm)表示时，相应的比例常数K称为摩尔吸光系数，以表示，其单位为L/(molcm)。这样，朗伯-比耳定律的数学表达式可以改写成： 摩尔吸光系数的物理意义是：浓度为lmol/L的溶液，于厚度为1cm的吸收池中，在一定波长下测得的吸光度。 bcA项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数之一，它反映吸光物质对光的吸收能力，也反映用吸收光谱法测定该吸光物质的灵敏度。物质对某波长光的吸收能力愈强，愈大，测定时灵敏度也就愈高。因此，为了提高分析的灵敏度，测定时通常选择大的有色化合物进行测定，选择具有最大值的波长作入射光。一般认为 灵敏度较低：6104L/(molcm)，。 摩尔吸光系数由实验测得。在实际测量中，不能直接取1mol/L这样高浓度的溶液去测量摩尔吸光系数，只能在稀溶液中测量后，换算成摩尔吸光系数。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 2、质量吸光系数a 质量吸光系数适用于摩尔质量未知的化合物。若溶液浓度以质量浓度(g/L)表示，液层厚度以厘米(cm)表示，相应的吸光度则为质量吸光度，以a表示，其单位为L/(gcm)。这样可表示为： 3、吸光度的加和性 在多组分体系中，在某一波长下，如果各种对光有吸收的物质之间没有相互作用，则体系在该波长处的总吸光度等于各组分吸光度的和，即吸光度具有加和性，称为吸光度加和性原理。可表示如下：abcAnAAAA 21总项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（四）偏离朗伯-比耳定律的因素 根据朗伯-比耳定律，A与c的关系应是一条通过原点的直线，称为标准曲线，斜率为b。 但实际上往往容易发生偏离直线的现象而引起误差，尤其在高浓度时更加突出，这种现象称为偏离光吸收定律（如图所示）。偏离主要源于朗伯-比耳定律本身的局限性、化学因素和光学因素。图1-6 标准曲线对光吸收定律的偏离示意图 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 1、朗伯-比耳定律本身的局限性 比尔定律是个有限定律，只适用浓度小于0.01mol/L的稀溶液。浓度高时，吸光粒子（质点）间平均距离减小，邻近质点彼此的电荷分布都会相互受到影响，将改变它们对特定辐射的吸收能力。这种影响的程度取决于物质的浓度，它可使吸光度与浓度之间的线性关系发生偏离。为此，在实际工作中，待测溶液的浓度应控制在0.01mol/L以下。吸光度与浓度之间线性关系的偏离还与溶液的折射率n有关，而溶液的折射率是随着溶液的浓度改变而改变的，所以也随浓度而改变。然而，实际上当浓度小于0.01mol/L时，n基本是不变的。 因此，光吸收定律在低浓度是正确的，只是在高浓度时才会受到限制，但不排除在高浓度时，采用差示分光光度法、多波长法等适当方式进行定量分析。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 2、化学因素 溶液对光的吸收程度决定于吸光物质的性质和数目。若溶液中发生了解离、碱反应、配位反应及缔合反应，则改变了吸光物质的浓度，导致偏离光吸收定律。若化学反应使吸光物质浓度降低，而产物在测量波长处不吸收，则引起负偏差；若产物比原吸光物质在测量波长处的吸收更强，则引起正偏差。因此，测量前的化学预处理工作是十分重要的，如控制好显色反应条件，控制溶液的化学平衡等，以防止产生偏离。 3、光学因素 吸收定律成立的前提是：入射光是单色光。但实际上，一般单色器所提供的入射光并非是纯单色光，而是包括一定波长范围的光谱带（此波长范围即谱带宽度）。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 入射光的谱带越宽，其误差越大。实验证明，只要所选的入射光，其所含的波长范围在被测溶液的吸收曲线较平坦的部分，偏离程度就要小，如图1-7所示。图1-7 入射光的非单色性对光吸收定律的影响示意图项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 学习情景一学习情景一 紫外紫外- -可见分光光度计的认知与操作可见分光光度计的认知与操作项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 一、紫外一、紫外/ /可见分光光度计的基本结构可见分光光度计的基本结构 紫外-可见吸收光谱测定所用的仪器是紫外-可见分光光度计（简称分光光度计），紫外-可见分光光度计的型号和种类很多，就其基本结构而言，都是由光源、单色器、吸收池、检测器和数据处理及记录装置（计算机）五部分组成，如图1-8所示。图1-8 紫外-可见分光光度计基本结构示意图项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（一）光源 光源提供入射光，使待测分子产生吸收。光源要能提供所需波长范围的连续光谱，具有良好的稳定性，光强度足够大，辐射能量随波长无明显变化，使用寿命长。常用的光源有可见光光源（热辐射光源）和紫外线光源（气体放电光源）。 钨灯、卤钨灯发射3252500nm的连续光谱，工作范围为3601000nm，稳定性好，常用于可见分光光度计的光源。卤钨灯的使用寿命及发光效率高于钨丝灯。 紫外光光源多为气体放电光源，应用最多的是氢灯、氘灯（185375nm)。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，是紫外区应用最广泛的一种光源，辐射强度比相同功率的氢灯要大35倍。近年来，具有高强度和高单色性的激光已被开发用作紫外光源。已商品化的激光光源有氩离子激光器和可调谐染料激光器。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（二）单色器 单色器是将来自光源的复合光分散为单色光的装置，由入射狭缝、色散元件、出射狭缝和透镜系统等组成，并分离出所需要波段的光束。单色器是分光光度计的核心部件，其性能直接影响出射光的纯度，从而影响测定的灵敏度、选择性和工作曲线的线性范围。单色器质量的优劣主要取决于色散元件的质量，常用的色散元件有棱镜和光栅。（a）棱镜单色器光路图 （b）光栅单色器光路图图1-9 单色器光路示意图项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （三）吸收池 吸收池又称比色皿，用于盛放溶液，有玻璃和石英两种材质。玻璃比色皿只能用于可见光区，石英比色皿可用于紫外区和可见光区。吸收池有多种尺寸，其规格是以光程为标志的，常用的吸收池的规格有：0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm、5.0cm等，一般为1cm。 同一台分光光度计的吸收池其透光度应一致，在同一波长下和相同溶液下，吸收池的透光度误差应小于0.5%，为了减小误差，在测量前应对吸收池进行配套性检验和对吸收池进行校正。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 吸收池使用注意事项如下： 1、拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面。同时注意轻拿轻放，防止外力对吸收池的影响，产生应力后破损。 2、装入参比溶液和待测溶液比色皿需要按要求进行洗涤，先用蒸馏水反复润洗34次，再根据实际测定过程，用参比溶液或待测溶液润洗34次。润洗完毕，一定用滤纸先吸干比色皿四周及底部的液滴，再用擦镜纸小心地擦拭光学面。注意用擦镜纸擦拭时一定要往一个方向进行擦拭；装液高度一般在3445之间。 3、凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液（特别是碱性物质）不得长期盛放在吸收池中。 4、不能将吸收池放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 5、当发现吸收池里面被污染后，应用乙醚和无水乙醇的混合液（各50%）清洗，及时擦拭干净。 6、不得将吸收池的透光面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为吸收池的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭。 7、切忌在用超声波清洗时，一定要注意时间不要超过半小时，功率不要太大，要用清洗玻璃器皿的超声波清洗机清洗，清洗时毛面朝下。 8、若太脏可用洗液清洗，但时间要短（几秒钟），再用清水清洗干净，切忌不能用洗洁精之类的清洁剂，以免影响测量。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （四）检测器 许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。检测器又称接受器，其作用是对透过吸收池的光做出响应，并转变成电信号输出，输出电信号的大小与透过光的强度成正比。 1、光电池 光电池根据半导体材料来命名，常用的光电池是硒光电池和硅光电池。不同的半导体材料制成的光电池，对光的响应波长范围和最灵敏峰波长各不相同。硒光电池对光响应的波长范围一般为250750nm，灵敏区为500600nm，而最高灵敏峰约在530nm。 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 光电池具有不需要外接电源、不需要放大装置而直接测量电流的优点。其不足之处是：由于内阻小，不能用一般的直流放大器放大，因而不适于较微弱光的测量。光电池受光照持续时间太久或受强光照射会产生“疲劳”现象，失去正常的响应，因此一般不能连续使用2h以上。 2、光电管 光电管在紫外-可见分光光度计中应用广泛。它是一个阳极和一个光敏阴极组成的真空二极管。按阴极上光敏材料的不同，光电管分蓝敏和红敏两种，前者可用波长范围为210625nm；后者可用波长范围为6251000nm。与光电池比较，它具有灵敏度高、光敏范围广和不易疲劳等优点。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 3、光电倍增管 光电倍增管是检测弱光最常用的光电元件，它不仅响应速度快，能检测10-810-9s的脉冲光，而且灵敏度高，比一般光电管高200倍。目前紫外-可见分光光度计广泛使用光电倍增管作检测器。 4、二极管阵列检验器 （五）数据处理及记录装置 光电倍增管将光信号转变成电信号，经放大后由数码管直接显示出透射比或吸光度由记录仪记录或用数字显示。这种数据显示装置方便、准确，避免了人为读数错误，而且还可以连接数据处理装置，能自动绘制工作曲线，计算分析结果并打印报告，实现分析自动化。 现在新型仪器都配置有微处理机，可以对很多数字信号进行记录和处理，同时也可对分光光度计进行操作控制。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 二、紫外/可见分光光度计的基本操作 目前紫外/可见分光光度计品种和型号繁多，虽然不同型号的仪器操作方法略有不同，但仪器上主要旋钮和按键的功能基本类似，在使用前应详细阅读仪器使用说明书。紫外/可见分光光度计的基本操作主要包括以下几个方面： 1、开机关机操作； 2、选择工作波长； 3、选择测量模式； 4、润洗比色皿，依次装入参比溶液和待测溶液； 5、用参比溶液进行调0，调100； 6、在吸光度模式下，测定待测溶液的吸光度。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 三、紫外-可见分光光度计的类型 根据使用波长范围分类： 1、可见分光光度计：波长范围是400780nm，只能用于测量有色溶液的吸光度； 2、紫外-可见分光光度计波长范围为200l000nm，可测量在紫外、可见及近红外有吸收的物质的吸光度。 根据光路数目可类：1、单光束式；2、双光束式。 根据测量时提供的波长数分类：1、单波长分光光度计；2、双波长分光光度计。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用图1-10 不同类型分光光度计示意图 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 四、紫外-可见分光光度计的校正和检验 为保证测试结果的准确可靠，新制造、使用中和修理后的紫外-分光光度计都应定期进行检定。国家技术监督局批准颁布了各类紫外-可见分光光度计的检定规程。检定规程规定，检定周期为半年，两次检定合格的仪器检定周期可延长至一年。在验收仪器时应按仪器说明书及验收合同进行验收。紫外-分光光度计的校验包括以下几方面： 1、波长准确度的检验； 2、透射比正确度的检验； 3、稳定度的检验； 4、杂散光的检验 5、吸收池配套性检验。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 五、紫外五、紫外- -可见分光光度计的维护与保养可见分光光度计的维护与保养（一）工作环境要求 1、仪器安放场所要求 仪器工作场所应与化学分析操作室隔开。分光光度计应安装在稳固的工作台上，避免强烈的振动和持续的振动。周围不应有强磁场，以防电磁干扰。室内照明不宜太强，应避免阳光直射。 2、仪器工作电源要求 仪器工作电源一般允许电压在220V10%，频率（50Hz1）HZ的单相交流电。为保持光源灯和检测系统的稳定性，在电源电压波动较大的实验室，最好配备功率不小于500W的稳压器（有过电压保护），实验室内应有地线并保证仪器有良好接地性。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 3、环境温度湿度要求 温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。室内应避免高温，温度宜保持在535。室内应干燥，相对湿度宜控制在45%65%，不应超过80。有条件时应具备四季恒湿的仪器室，配置恒温设备，特别是地处南方地区的实验室。 4、环境卫生要求 环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性，也是造成光学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此必须定期清洁室内环境，保障卫生条件，防尘。室内应无腐蚀性气体（如SO2、NO2、NH3及酸雾等）。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（二）仪器的日常维护与保养 1、光源 光源寿命有限，为延长光源使用寿命，应尽量减少开关次数，短时间内可以不关灯，长时间不用仪器要关闭电源灯，刚关闭的电源灯不要立即重新开启。仪器连续使用时间不应超过3h，如需长时间使用，可间歇30min。光源灯亮度明显减弱可不稳定时，应及时更换新灯。 2、单色器 单色器是仪器的核心部分，装在密封盒内，不能拆开。选择波长时应平衡轻轻转动，不可用力过猛。为防止色散元件受潮生霉，必须定期更换单色器盒内干燥剂（硅胶），若发现干燥剂变色，应立即更换。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 3、吸收池 必须正确使用吸收池，保护吸收池的两个光学面。 4、检测器 光电转换元件不能长时间曝光，且应避免强光照射或受潮积尘。 5、电源 仪器停止工作时，必须切断电源。 6、防尘 为了避免仪器积尘，在停止工作时，应盖上防尘罩。 7、定期通电 长时间不作用仪器，也要定期通电，每次不少于2030min，以保持整机呈干燥状态，并且维持电子元器件的性能。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用学习情景二学习情景二 紫外紫外- -可见吸收光谱法的实验技术可见吸收光谱法的实验技术 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用典型实例 一、食品中亚硝酸盐含量的测定（一、食品中亚硝酸盐含量的测定（GB5009.33-GB5009.33-20102010） 1.原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，在550nm处有最大吸收，测定吸光度以定量（或与标准比较定量）。 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 2.试剂 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。 （1）亚铁氰化钾溶液(106 g/L) （2）乙酸锌溶液(220 g/L) （3） 饱和硼砂溶液(50 g/L) （4）氨缓冲溶液（pH 9.69.7） （5）氨缓冲液的稀释液 （6）盐酸(0.1 mol/L) （7）对氨基苯磺酸溶液（4 g/L） （8）盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L） （9）亚硝酸钠标准溶液（200 g /mL） （10）亚硝酸钠标准使用液（5.0 g/mL）项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 3.仪器和设备 （1） 天平：感量为0.1 mg 和1 mg。 （2） 组织捣碎机。 （3） 超声波清洗器。 （4） 恒温干燥箱。 （5）分光光度计。 4.分析步骤 （1）试样的预处理 新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。如需加水应记录加水量。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。 乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪) ：将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。 发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。 干酪：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （2） 提取 称取5（精确至0.01 g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于50 mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。 （3） 提取液净化 在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液， 摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀,放置30min, 除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤, 弃去初滤液30mL,滤液备用。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （4） 亚硝酸盐的测定 吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0 、12.5亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min5min后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。 同时做试剂空白。 项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 5分析结果的表述 （1）亚硝酸盐含量的计算 亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按式（1-12）进行计算。式中： X试样中亚硝酸钠的含量，mg/kg； A测定用样液中亚硝酸钠的质量，g； m试样质量，； V测定用样液体积，mL； V0 试样处理液总体积，mL。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。 1000VVm1000AX0项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 6.精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。 7.实验说明 (1)亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀，使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀。 (2)饱和硼砂溶液作用：一是亚硝酸盐提取剂，二是蛋白质沉淀剂。 (3)亚硝酸钠易被氧化为硝酸钠，注意加热的温度和时间。 (4)显色时的pH值以1.93.0为宜，显色后稳定性与室温有关，显色温度为1530，在1530min内比色为好。 (5)当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成的偶氮化合物氧化，使红色消失，对结果产生影响。可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的方法，以防止氧化。 (6)盐酸萘乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 二、样品的制备（一）样品溶液的配制 紫外-可见吸收光谱法的测定通常是在溶液中进行，固体样品需转变成溶液，无机样品用合适的酸溶解或用碱熔融，有机样品用有机溶剂溶解或抽提。有时需要先经湿法或干法将样品消化，然后再转化成适合于光谱测定的溶液。为了得到一张如实反映样品性质的光谱图，对样品的纯化、溶液浓度和溶剂的选择都是至关重要的。固体样品在称量前必须干燥至恒重，除去溶剂和水分。溶液应澄清，若有浑浊物则必须先过滤。配制样品溶液的浓度对不同试样差别很大，必须调整浓度使吸收峰的顶端落在记录纸内。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （二）溶剂的选择 选择溶剂的条件除了与样品无反应外，还要求样品在溶剂中能达到一定浓度，以及在所要测定的波长范围内溶剂本身没有吸收。理想的溶剂应能溶解所有类型的化合物，不易燃烧且无毒，并在全波长区透明。水是最经济、透光率最好的溶剂，但对多数非极性样品不适用。 三、显色条件的选择 紫外吸收光谱法可以测定在近紫外光区有吸收的无色透明的化合物， 可见吸收光谱法需要加显色剂显色后再测定。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （一）显色剂的选择 反应生成物在紫外、可见光区有强光吸收，且反应有较高的选择性； 反应生成物稳定性好，显色条件易于控制，反应的重现性好； 有色化合物与显色剂之间颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与有色化合物对光的吸收有明显区别，一般要求两者的最大吸收峰波长之差大于60nm。 能同时满足上述条件的显色剂不是很多，因此要在初步选定显色剂后，认真研究显色反应条件。 （二）显色剂的用量 显色反应一般可用下式表示：M + R MR 被测组分 显色剂 有色化合物项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 显色剂应适当过量。通过作A-cR曲线，来获得显色剂的适宜用量。方法是：固定被测组分浓度和其他条件，然后加入不同量的显色剂，分别测定吸光度A值，绘制吸光度（A）-显色剂浓度（cR）曲线。图1- 11 吸光度与显色剂浓度的关系曲线图（a）曲线表明显色剂浓度在ab范围内吸光度出现稳定值，因此可以在ab间选择合适的显色剂用量。这类显色反应生成的配合物稳定，对显色剂浓度控制不太严格；图（b）曲线表明显色剂浓度在ab这一段范围内吸光度值比较稳定，在显色时要严格控制显色剂用量；图（c）曲线表明，随着显色剂浓度增大，吸光度不断增大，这种情况下必须十分严格控制显色剂加入量或者另换合适的显色剂。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 （三）显色的时间 显色（或发色）时间：是显色反应完成所需要的时间； 稳定时间：是显色后有色物质色泽保持稳定的时间。 确定适宜时间的方法：配制一份显色溶液，从加入显色剂开始，每隔一定时间测吸光度一次，绘制吸光度-时间关系曲线。曲线平坦部分对应的时间就是测定吸光度的最适宜时间。 （四）溶液的酸度 溶液的pH值对溶液中待测组分的存在状态、显色剂本身颜色以及对显色反应本身存在影响。项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用 具体做法是固定溶液中待测组分和显色剂的浓度，改变溶液(通常用缓冲溶液控制)的酸度(pH)，分别测定在不同酸度下溶液的吸光度A，绘制A-pH曲线（如图1-12所示），从中找出最适宜的pH范围。图1-12 A-pH关系曲线项目一项目一 紫外紫外-可见吸收光谱法及应用可见吸收光谱法及应用（五）反应的温度 吸光度的测量都是在