细胞融合和单克隆抗体制备课件.ppt

细胞融合和单克隆抗体制备2.2.22.2.2细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体 细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体 ： 对所列知识点要知道其含义，能够在试题所给予的对所列知识点要知道其含义，能够在试题所给予的相对简单的情境中识别和使用它们。相对简单的情境中识别和使用它们。： 理解所列知识和其他相关知识之间的联系和区别，理解所列知识和其他相关知识之间的联系和区别，并能在较复杂的情境中综合运用其进行分析、判断、推理并能在较复杂的情境中综合运用其进行分析、判断、推理和评价。和评价。回顾：回顾： 1、抗体的化学本质？ 2、抗体由什么细胞产生？ 抗体抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。球蛋白。 B B淋巴细胞（浆细胞）产生抗体。淋巴细胞（浆细胞）产生抗体。小资料：小资料：2010年全球治疗用单克隆抗体药物的销售总额达年全球治疗用单克隆抗体药物的销售总额达到到440亿美元，如果加上亿美元，如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试亿美元的单抗诊断和研究试剂，单抗药物的市场总量达到剂，单抗药物的市场总量达到550亿美元。亿美元。2011年单抗药年单抗药物的市场总量已经达到物的市场总量已经达到628亿美元。到亿美元。到2015年，全球单克年，全球单克隆抗体药销售额达隆抗体药销售额达980亿美元。我国的单克隆抗体药物从亿美元。我国的单克隆抗体药物从无到有，并且在我国医药市场发挥越来越重要的作用。目无到有，并且在我国医药市场发挥越来越重要的作用。目前我国单抗市场规模每年以前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度递增。以上的速度递增。 准确识别各种抗原物质，并与特异性结准确识别各种抗原物质，并与特异性结合，可以起到合，可以起到 把某种抗原把某种抗原反复注射反复注射到动物体内，然后从动物到动物体内，然后从动物血清中分离血清中分离出所需抗体。出所需抗体。浆细胞浆细胞 产量低，纯度低，且产量低，纯度低，且抗体的特异性差。抗体的特异性差。回顾体液免疫过程回顾体液免疫过程思考思考1：传统的生产：传统的生产抗体方法是？抗体方法是？思考思考2：用该方法生产：用该方法生产抗体有什么抗体有什么缺点缺点？1 1个个B B细胞细胞 B B细胞群细胞群 大量专一抗体大量专一抗体 1.1.克隆单一的克隆单一的B B淋巴细胞，形成淋巴细胞，形成B B细胞群，需要用到什么技术？细胞群，需要用到什么技术？2.2.对对B B细胞进行细胞进行可行可行吗？为什么？吗？为什么？3.3.哪种细胞可以大量增殖呢？哪种细胞可以大量增殖呢？4.4.如何获得既能产生专一抗体，如何获得既能产生专一抗体，又能无限增殖的细胞呢？又能无限增殖的细胞呢？如何制备纯度高、特异性强的抗体呢？如何制备纯度高、特异性强的抗体呢？设计方案设计方案1 1：单克隆抗体：由单克隆抗体：由单一单一B B细胞细胞克隆产生的高度专一、克隆产生的高度专一、仅针对某一特定抗原的抗体。仅针对某一特定抗原的抗体。 杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术诱导细胞融合需诱导细胞融合需要什么技术？要什么技术？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞一种特定一种特定B细胞细胞设计方案设计方案2 2：既能分泌抗体既能分泌抗体又能无限增殖又能无限增殖细胞膜的流动性灭活病毒、PEG、电激等诱导的手段？原理？动物细胞融合动物细胞融合融合成功的标志：细胞核融合成功的标志：细胞核融合融合比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合融合原理融合原理融合的方法融合的方法诱导方法诱导方法用途用途细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞的全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性去壁后诱导原生质去壁后诱导原生质体融合体融合使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备注射抗原注射抗原B B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合注射抗原的目的是注射抗原的目的是什么？什么？单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备诱导产生相应的诱导产生相应的效应效应B B细胞细胞诱导细胞融合后，培养诱导细胞融合后，培养基中有几类细胞？基中有几类细胞？B淋巴细胞淋巴细胞B淋巴细胞淋巴细胞B淋巴细胞淋巴细胞B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）（杂交瘤细胞）单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备注射抗原注射抗原B B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞 资料分析资料分析1 1：细胞内细胞内DNADNA复制有复制有D D和和S S两条途径两条途径，其中，其中D D途径能被氨基嘌呤阻断途径能被氨基嘌呤阻断。B B淋巴细胞中有这两条淋巴细胞中有这两条DNADNA合成合成途径途径，但，但体外培养时一般不会分裂增殖体外培养时一般不会分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中鼠骨髓瘤细胞中没有没有S S途径途径，但能不断分裂增殖。，但能不断分裂增殖。多种杂交瘤细胞多种杂交瘤细胞思考：请根据资料设计思考：请根据资料设计方案选出杂交瘤细胞。方案选出杂交瘤细胞。选出杂交瘤细胞都能产生选出杂交瘤细胞都能产生同一种抗体吗？为什么？同一种抗体吗？为什么？ 方案：选择培养基培养方案：选择培养基培养（即加入氨基嘌呤）（即加入氨基嘌呤） 结果：杂交瘤细胞结果：杂交瘤细胞24孔板孔板 资料分析资料分析2 2：（：（1 1）多孔细胞培养板：将细胞培养液稀释）多孔细胞培养板：将细胞培养液稀释后，转移到多孔细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，后，转移到多孔细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。通过培养让其增殖。（2 2）抗体能够特异性识别抗原并与之结合。）抗体能够特异性识别抗原并与之结合。思考：请根据资料设计思考：请根据资料设计方案选出能产生专一抗方案选出能产生专一抗体的杂交瘤细胞。体的杂交瘤细胞。方法：克隆化培养方法：克隆化培养+抗体检测抗体检测结果：能产生专一抗体的杂交结果：能产生专一抗体的杂交瘤细胞瘤细胞多种杂交多种杂交瘤细胞瘤细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗体专一抗体检验阳性检验阳性克隆化培养克隆化培养 筛选筛选2 2单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备产生专一产生专一抗体的杂抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞归纳提升：归纳提升：制备单克隆抗体过程中两次制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法、目的？筛选的方法、目的？多种杂交多种杂交瘤细胞瘤细胞选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1专一抗体检专一抗体检验阳性验阳性克隆化克隆化培养培养单克隆单克隆抗体抗体 筛选筛选2 2培养杂交瘤细胞的培养杂交瘤细胞的方法有哪两种？方法有哪两种？单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高，并并可大量制备可大量制备。产生专一性抗体的产生专一性抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞1 1、作为诊断试剂、作为诊断试剂2 2、用于治疗疾病和运载药物、用于治疗疾病和运载药物准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速 把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成制成“生物导弹生物导弹”。应用主要有：应用主要有：单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备“生物导弹生物导弹” 单克隆抗体药物单克隆抗体药物1.1.完成学案中单克隆抗体的制备过程流程图完成学案中单克隆抗体的制备过程流程图 分组展示分组展示1.1.背诵记忆以下问题，同位间相互检测背诵记忆以下问题，同位间相互检测（1 1）为何要给小鼠注射抗原？获取的）为何要给小鼠注射抗原？获取的B B淋巴细胞只有一种吗？淋巴细胞只有一种吗？（2 2）制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？（3 3）如何诱导）如何诱导诱导诱导细胞融合？细胞融合？细胞融合后，培养基中有几类细胞？细胞融合后，培养基中有几类细胞？（4 4）单克隆抗体的制备过程中单克隆抗体的制备过程中两次筛选方法、目的两次筛选方法、目的分别是什么分别是什么 ？ （5 5）杂交瘤细胞的特点？单克隆抗体的优点？）杂交瘤细胞的特点？单克隆抗体的优点？（6 6）杂交瘤细胞的培养方法有哪两种？）杂交瘤细胞的培养方法有哪两种？（7 7）制备过程采用了哪些动物细胞工程技术手段？）制备过程采用了哪些动物细胞工程技术手段？（8 8）单克隆抗体的应用？）单克隆抗体的应用？记忆整合记忆整合思考：思考：1.1.本过程利用了哪些原理？本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2.2.为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？ 杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B B细细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体得大量单克隆抗体3.3.两次筛选的方法和目的？两次筛选的方法和目的？（1 1）用选择性培养基，选出多种杂交瘤细胞；）用选择性培养基，选出多种杂交瘤细胞；（2 2）克隆化培养和抗体检测，选出能产生特定（单一或相应）克隆化培养和抗体检测，选出能产生特定（单一或相应）抗体的杂交瘤细胞。抗体的杂交瘤细胞。4.4.单克隆抗体的优点单克隆抗体的优点特异性强，灵敏度高、可以大量制备特异性强，灵敏度高、可以大量制备1 1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是 A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B.B.没经过免疫的没经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.没经过免疫的淋巴细胞没经过免疫的淋巴细胞A2.2.动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较中，正确的是A.A.诱导融合的方法完全相同诱导融合的方法完全相同 B.B.所用的技术手段基本相同所用的技术手段基本相同 C. C. 操作步骤基本相同操作步骤基本相同 D. D. 都能形成杂种细胞都能形成杂种细胞 D3. 3. 单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是A.A.由小鼠能产生抗体的由小鼠能产生抗体的B B淋巴细胞与肝细胞融合淋巴细胞与肝细胞融合 B.B.由小鼠一个由小鼠一个B B淋巴细胞诱导融合而成淋巴细胞诱导融合而成 C.C.由小鼠一个由小鼠一个B B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成 D.D.由小鼠一个由小鼠一个B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成 D变式训练1 1、完成步步高、完成步步高243243页第页第2 2题题2.单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广泛应用于疾病的诊断和治疗。用泛应用于疾病的诊断和治疗。用H7N9病毒制备单克隆抗体的流程如下病毒制备单克隆抗体的流程如下图所示：图所示：2014新课标新课标，40某研究者用抗原某研究者用抗原(A)分别免疫分别免疫3只同种小鼠只同种小鼠(X、Y和和Z)，每只小鼠免疫，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图，结果如下图所示。所示。若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞淋巴细胞(染色体数目染色体数目为为40条条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目为染色体数目为60条条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。抗体的杂交瘤细胞。1 1、完成步步高、完成步步高244244页第页第3 3题题回答下列问题：回答下列问题：(1)制备融合所需的制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到达到16 000以上，以上，则小鼠最少需要经过则小鼠最少需要经过_次次免疫后才能有符合要免疫后才能有符合要求的。达到要求后的求的。达到要求后的X、Y、Z这这3只免疫小鼠中，最适合用于制备只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是淋巴细胞的是_小鼠，理由是小鼠，理由是_。(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交廇细胞外，廇细胞外，还含有还含有_，体系体系中出现多种类型细胞的原因中出现多种类型细胞的原因是是_。(3)杂交瘤细胞中有杂交瘤细胞中有_个个细胞核，染色体数目最多是细胞核，染色体数目最多是_条。条。(4)未融合的未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是_。课堂小结动物细胞工程植物细胞工程基础技术原理结果动物细胞培养动物细胞融合核移植技术植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养植物组织培养细胞增殖细胞膜具有流动性动物细胞核的全能性植物细胞全能性细胞膜具有流动性、植物细胞全能性细胞或细胞产物杂交细胞克隆动物植物体杂种植株