实验十七-动物球虫病实验室诊断技术(共11页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上实验十七 动物球虫病实验室诊断技术一、实验目的及要求1.熟悉球虫卵囊的形态特征。2.掌握分离球虫卵囊的方法。3.了解常见球虫的种类。4.熟悉鸡球虫感染后的病变记分和粪便记分方法。二、实验器材1.仪器设备。 上海XSP-2C生物显微镜（具备10倍目镜和低倍、高倍物镜及油镜）；目镜测微尺和物镜测微尺；盖玻片、载玻片、牙签、洗瓶、平皿；剪刀及手术刀；离心管；血细胞计数板。2.实验材料。 感染球虫的患鸡,常见的球虫卵囊,蔗糖、食盐、硫酸镁、铬硫酸、重铬酸钾等。三、实验方法、步骤和操作要领（一）球虫的形态观察 随宿主粪便排出的卵囊呈卵圆形、圆形或球形；无色、淡黄色或淡绿色，其形态大小随球虫种类而异。外被有两层囊壁，外壁较厚，轮廓清晰；内壁较薄。内含颗粒状的胞质(即原生质团)。卵囊内具有一至多个孢子囊，每个孢子囊内含有一至多个子孢子，因种类而异。艾美耳属的球虫种类经发育后，原生质团分裂为四个孢子囊，每个孢子囊内含有两个子孢子。有些种类的球虫在卵囊的极端具有明显的卵膜孔，有些球虫的卵囊内膜突出于卵膜孔之外，形成极帽。畜禽常见球虫的种类：1牛球虫。 文献报道的有10种，其中9种为艾美耳属（Eimeria）球虫，另外一种为阿沙卡等孢球虫（Isospora akscaica）。以邱氏艾美耳球虫(E. zurnii)致病力最强，牛艾美耳球虫(E.bovis)致病力较强，它们寄生于牛消化道的上皮细胞。(1)邱氏艾美耳球虫(E. zurnii)。 卵囊呈亚球形或球形，平均直径为18.6×14.6。淡黄色，无卵膜孔，胞质充满整个卵囊，无极体。卵囊孢子化时间为2472小时。(2)牛艾美耳球虫(E.bovis)。 卵囊呈卵圆形，褐色，有卵膜孔，平均大小27.7×20.3，卵囊孢子化时间为4872小时。2. 兔球虫。 种类很多，有16种，属艾美耳属。仅介绍两种如下。(1)斯氏艾美耳球虫(E.stiedae)。 寄生于肝、胆管上皮细胞内。致病力最强。卵囊甚大，长椭圆形，大小为2640×1625，略带淡红色，囊壁较厚，具卵膜孔。(2)穿孔艾美耳球虫(E.perforans)。 寄生于肠上皮细胞内。卵囊甚小，椭圆形，两端较钝，无色，大小为13.330.6×10.617.3，卵膜孔不明显。3. 鸡球虫。 报道的有9个种，属艾美耳属，世界公认的有7个种。(1) 柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)。 寄生于盲肠，多为宽卵圆形，少数为椭圆形，原生质呈淡褐色，卵囊壁为淡黄绿色（图17-1）。其卵囊平均大小为22×19，形状指数为1.16，裂殖体很大，直径可达54，第一代裂殖体包含的裂殖子可达900个，第二代为350个，最短孢子化时间为18，最短潜隐期为115。 图17-1柔嫩艾美耳球虫卵囊(2) 毒害艾美耳球虫（E.necatrix）。 其第一、二代裂殖生殖在鸡小肠，第三代裂殖生殖和配子生殖在盲肠。卵囊呈卵圆形，大小为13.222.7×11.318.3，囊壁无色、光滑。具极粒，孢子囊呈卵圆形，有斯氏体，无残体（见图17-2）。图17-2毒害艾美耳球虫卵囊 (3) 堆型艾美耳球虫（E.acervulina）。 寄生于十二指肠。卵囊呈卵圆形，大小为17.720.2×13.716.3。光滑，卵囊壁淡黄绿色。孢子囊呈卵圆形，有斯氏体，具极粒，无残体（图17-3）。图17-3堆型艾美耳球虫卵囊(4) 布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。 寄生于小肠后段、直肠和盲肠近端区。卵囊平均大小为18.8×24.6，是鸡球虫中仅次于巨型艾美耳球虫的第二大型卵囊。形状指数为1.31。有一极粒，无残体和卵膜孔。裂殖体直径为30。孢子化时间为18，潜隐期为120。(5) 巨型艾美耳球虫(E.maxima)。 寄生于小肠中段。卵囊很大，是鸡球虫中最大型的卵囊，最大的卵囊达到42.529.8。卵囊呈卵圆形，一端钝圆，一端较窄，黄褐色，囊壁浅黄色。其形状指数为1.47。最大的裂殖体直径为9.4。（图17-4）。图17-4 巨型艾美耳球虫卵囊(6) 和缓艾美耳球虫(E.mitis)。 寄生于鸡小肠前段。卵囊较小，近球形，卵囊壁为淡黄绿色，有一极粒，无卵膜孔，也无残体。卵囊平均大小为15.6×14.2，最短孢子化时间为15h.（图17-5）。图17-5和缓艾美耳球虫卵囊 (7) 早熟艾美耳球虫（E.praecox）。 寄生于小肠上段13处。卵囊呈卵圆形或椭圆形，平均大小为21.3×17.1，形状指数为1.24，囊壁光滑，呈淡黄绿色，原生质无色，无卵膜孔和残体，具极粒。孢子囊无残体。（图17-6）。 图17-6 早熟艾美耳球虫卵囊4. 鸭球虫。 鸭球虫常见于北京鸭群中，对北京鸭具有致病力的球虫有两种。（图17-7）。（1）毁灭泰泽球虫（Tyzzeria perniciosa）。 寄生于小肠前段，致病力强。卵囊呈短椭圆形，较小，呈淡绿色，大小为13.29.2×9.97.2，形状指数为1.2。无孢子囊，8个子孢子呈香蕉状，大小为7.2×2.7。（2）菲莱氏温杨球虫（Wenyonella philiplevinei）。 寄生于小肠，致病力弱。卵囊呈卵圆形，浅淡绿色，外层薄而透明，内层浅蓝，大小为2213×1210，有卵膜孔，形状指数为1.5。孢子囊呈瓜子形，大小为7.2×4.8，具斯氏体。图17-7 鸭球虫卵囊1.毁灭泰泽球虫 2. 菲莱氏温杨球虫（二）卵囊的分离与孢子化1卵囊的分离。 卵囊存在于宿主粪便和组织中。分离粪便中的卵囊较多采用饱和食盐(或硫酸镁、蔗糖等)溶液漂浮法和离心法；分离组织中的卵囊一般采用铬硫酸分离法和蛋白酶消化法。单卵囊分离法是指从混合虫种的卵囊中分离出单个卵囊，以备进一步扩增所需的“克隆”卵囊。尽管有许多分离卵囊的方法，但其基本原理是一样的，即根据卵囊与杂质比重的不同。对于组织中的卵囊，尚需借助消化液或酸的作用，破坏组织中的细胞，以利卵囊的提纯。（1）漂浮法。 可用很多种溶液和很多种方法，其关键是溶液的比重要适当(一般 1.2左右)；再者，溶液对卵囊的活性没有不良影响。这里介绍几种常用方法： 糖溶液漂浮法。a. 糖溶液的制备。 称500g糖和6.5g石碳酸(或67ml石碳酸溶液)溶于320ml蒸馏水中即可。此法配制的溶液也常称为Sheather氏糖溶液。b.卵囊的分离。(a) 在一容器里将粪便和2倍于粪便体积的自来水(或生理盐水，或食用专用洗剂如 0.5%莱喷液等)混成均匀的悬浮液。(b) 将粪便混悬液经两层粗棉布(或先经50目后经100200目网筛)滤到第二个容器中，再与等量Sheather氏糖溶液混合，而后将混合液注入离心管中。(c) 离心(3000rpm，3min)。(d) 用直径略小于离心管口径的捞网(2050目)捞取表层浮液,抖落于另一盛水容器中。水的多少视卵囊的多少而定，卵囊多带进的糖溶液也多，应多加水稀释。(e) 离心(3000rpm，3min)，沉淀物即为所需卵囊。 饱和食盐溶液漂浮法。a.饱和食盐溶液的配制。 在1000m1开水中加食盐380g，充分搅拌，比重约为1.18。b.卵囊的分离。(a) 将粪便和5倍于粪便体积的生理盐水搅成混悬液。(b) 将粪便混悬液经两层粗棉布(或先经50目后经100200目网筛)滤过到第二个容器中，并将第二个容器中的滤过液倒入离心管中。(c) 离心(3000rpm，3min)，弃去上清液。(d) 向沉淀中加入10倍的饱和盐水(先加少许，充分混匀后再加其余的)充分混匀。(e) 离心(3000rpm，3min)。(f) 同糖溶液漂浮法，捞取表层浮液，离心取沉淀。 饱和硫酸镁溶液漂浮法。a.饱和硫酸镁溶液的配制。 称64.4g硫酸镁于1000m1温水中充分搅拌溶解即成。b.卵囊的分离。 步骤同前法，只是悬浮液换为饱和硫酸镁溶液而已。鸭球虫的两个种：菲莱氏温扬球虫和毁灭泰泽球虫的卵囊在饱和食盐水中较易变形，以此法分离为佳。 铬硫酸分离法。适用于从肠内容物、肠粘膜组织、肝组织、肾组织及其它组织中分离球虫卵囊。无菌条件下操作时所制备的卵囊为无菌卵囊。a.铬硫酸溶液的制备。 先配好20%的重铬酸钠溶液100ml于500ml锥形瓶中，然后在冰浴条件下逐渐加入浓硫酸100m1，边加边充分搅拌。用玻璃过滤器或离心方法除去其它结晶，即为所需铬硫酸液。b.卵囊的分离。(a)将组织或肠内容物放在乳钵中充分研碎，加水充分搅拌后离心(1500 rpm，5min)。(b)向沉淀物中加入45倍铬硫酸溶液，冰浴条件下充分搅拌，然后立即离心(1500 rpm，5min)。(c)将浮液中的卵囊用吸管吸出，加入20倍以上的冷却水(冰水)，离心(1500rpm，5min)，沉淀物即为卵囊。(2)蛋白酶消化法。 在分离组织中的卵囊时，常有许多组织碎块或细胞团块混杂于卵囊中或粘附卵囊壁上，致使纯化工作十分棘手。在捣碎的组织中加入0.5%1%胰蛋白酶，将 pH调到8.0，39下消化20min；或者加入0.2%胃蛋白酶(蒋建林、蒋金书，1996)，将pH调至2.0，在39下消化1h，使卵囊分散游离出来，再依次用200目、300目和400目网筛过滤，滤液经2000rpm，10min离心沉锭，弃掉上清液，在沉淀中加入1 M蔗糖溶液，2000rpm，10min离心，管上层漂浮的白色似“塞子状”的物质即为卵囊。将其移入装有0.5 M蔗糖溶液小离心管中，2000rpm离心10min沉淀，重复几次充分洗涤除去比重较小的杂质，然后加入5%次氯酸钠，在4下作用10min，最后在低浓度(0.5M)的蔗糖溶液中离心洗涤，除去小的杂质和次氯酸钠，即可得纯化的未孢子化卵囊。(3) 糖溶液梯度离心法。 适用于从少量溶液中分离卵囊。 糖溶液的制备。 将128g精制白糖溶解于100m1水中，以此作为总量，加入0.5%石碳酸，混匀作为A液。以A液为基础，再按下述混合比，制成B、C、D液。 B液：3份A液+1份水，充分混合 C液：3份B液+1份水，充分混合 D液：3份C液+1份水，充分混合 梯度离心管的装备。 用1050 m1的离心管，从底部开始，轻轻将等量的A、B、C、D液分层次地依次加入管中。这几种液体不得相互掺混。 卵囊的分离。a.将粪便混匀在5倍体积的水中，离心(1000rpm，3min)，弃去上清液。b.沉淀物加1/2体积的水，混匀后取少量放置在D液的上部，厚度约为1cm。离心(1 000 rpm，3 min)。c.用吸管将液层上部的液体吸掉，只将D液层(含卵囊)移入另外的离心管中，用大约 10倍的水稀释后，离心(2000rpm，5min)。沉淀物即为卵囊。(4) 单卵囊分离(扩增)法。 稀释法 。a.将粪便或组织捣碎物混匀在20倍体积的2.5%重铬酸钾溶液中，置2527下培养27天，至95%的卵囊孢子化。b.培养物经3层纱布或50目网筛过滤。c.用干净的滴管吸取滤过物一小滴于载玻片上，并加一滴生理盐水稀释，使在低倍显微镜下观察时，一个视野只有12个卵囊。d.在显微镜下，右手持玻璃毛细吸管的尖端正对视野中的一个卵囊时，将吸管向卵囊直伸过去，卵囊随溶液吸入毛细吸管内。e.把毛细吸管中的液体吹落到铺有薄层琼脂的载玻片上，在显微镜下观察，确证是一个卵囊时，单卵囊分离即告完毕。分离单卵囊的目的是为了进一部扩增其“克隆”卵囊，操作步骤如下：f.用细的解剖刀将玻片上含有单卵囊小滴液的琼脂周围划破，以小滴液为中心，将前后左右的琼脂薄膜摺叠覆盖起来。g.将包有卵囊的琼脂团小心地喂给一日龄的雏鸡。h.感染后，雏鸡需隔离饲养。于感染后第2天开始，每天检查粪便，观察有无卵囊排出。i.收集粪便中的克隆卵囊。 显微操作器分离法。 高级显微镜都有显微操作器，可在显微视野下方便地吸取所需的单个卵囊或其它发育阶段的球虫(如孢子囊，子孢子，裂殖子，裂殖体，配子和配子体等)。2.孢子化。 卵囊孢子化需要合适的温度和湿度及充足的氧气。可以在分离卵囊前也可在分离卵囊后进行。因为杂质的存在影响氧气的扩散，致使卵囊摄入氧不足，发育不良；加上培养(孵化)卵囊时，细菌的生长常常竞争消耗氧气，所以，用水培养卵囊时应添加青霉素和链霉素 (1000IUm1)，或者用具抑菌作用的液体来培养。最好的培养液是2.5%的重铬酸钾液。向盛有分离卵囊的平皿中加入一定量的培养液，放在2528的恒温箱中培养17天。此间每天应对培养液轻轻搅拌35次，并观察孢子发育情况，当有80%以上的卵囊完成孢子化时，停止培养。完成孢子化的卵囊(或称成熟卵囊、感染性卵囊、孢子化卵囊)内含有 4个孢子囊，孢子囊前端的斯氏体清晰可见，孢子囊内的2个子孢子的折光体也清楚。如果有加氧器，则可以用生理盐水瓶或其它容器培养。孢子化卵囊应放入10倍体积以上的2.5%的重铬酸钾液中，低温37下保存。在这种条件下，卵囊的感染性可保持一年以上。（三）鸡球虫病的诊断技术1.卵囊计数方法。 主要用于计算克粪便和克垫料中球虫卵囊数值(OPG)或实验室内收集的卵囊悬液和球虫疫苗保存液中的卵囊数值。常用方法有以下几种：(1)血球计数板计数。 方法是称取1g鸡粪，溶于10m1水中制成10倍的稀释液，经充分搅拌均匀后，取其1滴置血球计数板中，在低倍镜下计算计数室四角4个大方格(每个大方格又分为16个中方格)中球虫卵囊总数，除以4求其平均值，乘104即为1ml液体的卵囊数。然后乘10即为OPG值。如果计数室四角没有大方格则用正中的一个大方格，连数几次，求其平均数，乘105即为OPG值。计算公式：OPG =a×10×1/(0.1×0.1×0.01)=a×105（2）载玻片计数。 从上述的10倍稀释液中，取出0.05ml置于载玻片上，再覆加盖玻片，计数整个盖玻片内的卵囊。计算公式：OPG =b×10×1/0.05=b×200(3) 浮游生物计算板计数。 从上述的10倍稀释液中，吸取0.04m1，滴于浮游生物计算板中，覆加32mm×28mm的盖玻片，然后数出64列中的10列所见到的卵囊数。计算公式：OPG =c×10×1/0.04×64/10=c×1600注：a、b、c为数到的卵囊数。(4) 麦克马斯特法(McMaster's method)。 计数时取粪便2g置研钵中，先加入10m1水，搅匀，再加饱和盐水溶液50m1，混匀后立即吸取粪液充满两个计数室，静置12min，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1×1×0.150.15m1，0.15ml内含粪便2/（10+50）× 0.15 =0.005g，两个计数室则为0.01g。故所得卵囊数乘100即为OPG值。计算公式：OPG =a×l00(5) 铬硫酸卵囊计数法。 先向25g鸡粪中加入2030ml的水，经充分搅拌后，取出2m1放入带刻度的离心管中(10ml装)，进行离心(2000rpm，5min)。离心后除去上清液，测出粪的容量。用10倍的铬硫酸溶液(20%重铬酸钠溶液，加入等量的硫酸，再用玻璃滤器将析出的结晶除去后的滤液)稀释，用水管的流水不断冷却离心管的外壁，再向粪液中加入铬硫酸溶液，充分搅拌。因操作过程发生气泡，故静置5min使气泡释出后检查为宜。此外，由于雏鸡个体的粪便状态不尽相同，例如从粪便排出到采样的间隔时间所致干燥程度上的差异及症状轻重不同所致水分含量的差异等条件，对通过称量鸡粪计算OPG值具有明显影响。为此，可以采用以下方法:先将鸡粪便溶于适量水中，再将粪液放入带有刻度的离心管中，通过离心(2000rpm，5min)，舍去上清液，通过离心管上的刻度测出沉渣的容量，再重新加水制成10倍的稀释液，然后计算卵囊的数量。2.鸡球虫各发育阶段虫体的检查。 在肠组织或粪便涂片上证实确有虫体(子孢子，滋养体，裂殖子，裂殖体，大、小配子体，大、小配子，合子，卵囊)存在，便可确诊为球虫感染；而根据鸡群的表现，诸如生产性能、临床症状和病变记分等，以及每克粪便或垫料中的卵囊数，便可判断鸡群是仅仅有球虫感染，还是在流行亚临床型或临床型球虫病。（1）具体操作。 用小型外科刀从最显著的感染区域取材，并在所有病例中从每一处至少取两个样品，一个取自粘膜表层，另一个取自粘膜的深处。浅层刮取物的显微镜观察应该查到卵囊或其它阶段虫体，深层刮取物应该查到内生发育阶段的虫体。显微镜检查结果可用于确定引起感染的艾美耳球虫种。对虫体内生阶段形态不熟悉的诊断人员，最好先做涂片进行姬姆萨染色。(2) 各阶段虫体形态简述。子孢子呈香蕉形，其最显著和最典型的结构是折光体。通常有2个折光体，一前一后。结构致密、匀质、无界膜。折光体大小可以变化，偶尔无前端的折光体。光学镜下观察，折光体发亮，不透明；染色后，折光体着色深而均匀。滋养体呈圆球形，单个细胞核，姬姆萨染色时，核着色较深呈暗红色。成熟裂殖体形状为圆球形，由许多香蕉形裂殖子紧凑地排列组成，类似于剥皮后的桔子外观。裂殖体成熟后，裂殖子成簇散开。裂殖子一端钝圆，一端稍尖，单个细胞核位于偏中部，胞质呈颗粒状结构，内有空泡。姬姆萨染色后核呈深红色，胞质呈淡红色。姬姆萨染色涂片上见到的成熟配子体的胞浆内含紫色颗粒，大小不等，白色颗粒散在核的周围，核浅红色。大配子呈亚球形，细胞浆中含有一层或两层嗜酸性颗粒，由粘蛋白组成，镜下观察细胞浆呈大理石状外观。成熟小配子体近似球形，内含近千个深紫色眉毛状小配子，成熟后小配子向外散出，中央留有残体。合子呈亚球形，大小与大配子相似，大、小配子结合后形成合子，此时大配子细胞浆中的嗜酸性颗粒即开始向周边膜下迁移，由于颗粒状物位于膜下即可与大配子区别。之后颗粒状物均匀散开，凝固形成卵囊壁。卵囊呈圆形、椭圆形、卵圆形。囊壁两层，个别种较小端有卵膜孔。在组织中的卵囊内有颗粒状的孢子体；垫料及粪便中的卵囊，部分已孢子化，内含4个孢子囊；每个孢子囊中有2个子孢子。3.卵囊鉴定方法。(1)大小。 虽然卵囊的大小可能有助于确定种，但也有其局限性；除巨型艾美耳球虫与和缓艾美耳球虫之外，单独用此特征鉴别虫种尚有困难。操作者不测算而试图判别卵囊大小是不现实的。用目镜测微尺测大量卵囊后，其大小才是有用的标准。卵囊长、宽的最大值、最小值和平均值均需列出。卵囊大小仅是球虫种鉴别中几个有用特征之一。任何确定种的卵囊大小总有不同，因此对虫种的任何判断必须依赖于测量至少50个卵囊的平均大小。(2) 颜色。 只有巨型艾美耳球虫凭其外形和颜色可与其它6个种区别开。该种最有用的特征是卵囊醒目的金黄色。其它种是浅绿色或无色。巨型艾美耳球虫卵囊壁外层有时局部呈波浪状，而其它种则光滑。这些特征有助于鉴定出该种。(3) 形状。 柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫是长椭圆形到卵圆形；和缓艾美耳球虫是亚球形到球形。对这些特征必须加以量化(形状指数)，方能更有助于种的鉴别；其量化的公式如下：形状指数=平均长度/平均宽度(4) 孢子化时间。 虫种之间的孢子化时间应该在标准温度下进行测定才有比较意义。虫种最适孢子化温度在2830的范围内。粪便样品必须在排出lh内收集，卵囊必须经过滤和饱和盐水漂浮后迅速从粪便中分离出来。随后悬浮在2%4%重铬酸钾溶液的平皿中，在30下孵育；按规定时间间隔在显微镜下检查样品，当发育完全的孢子囊出现于第一个卵囊时记录孢子化时间。4.鸡球虫感染的病变记分。病变的严重性通常是和鸡摄入卵囊数量成比例的，并且是和其它指标如增重和记分相关的。最常用的记分方法是由Johnson和Reid(1970)设计的病变记分法。按照这种方法，把肠道病变分为0+4五个等级，0表示正常，+4表示最严重的病变。这一技术在实验感染中最为常用，虽然因测定人的不同而有主观影响，及时用药和疫苗接种的鸡只评分不准，但由于其快速、实用的特点，仍不失为较好的诊断技术。在试验条件下，卵囊和药物的剂量都是指定的，虫种也是已知的。在野外条件下，病变记分对于测量感染的严重性也往往是有用的。即使同时存在几种球虫，通常也只需将小肠分为4段来记分。包括：十二指肠袢的小肠上段；小肠中段，即卵黄蒂上端及下端各10cm的肠道；小肠下段和直肠；盲肠。（1）混合感染情况下肠道病变记分。0分，无肉眼可见病变；+1分，有少量散在病变；+2分，有较多稀疏的病变，如多处肠区被感染和由柔嫩艾美耳球虫感染引起的盲肠出血；+3分，有融合性大面积病变，一些肠壁增厚；+4分，病变广泛融合，肠壁增厚。柔嫩艾美耳球虫感染，可见大型盲肠芯，巨型艾美耳球虫感染，可见肠内容物带血。（2）单个虫种感染情况下肠道病变记分。柔嫩艾美耳球虫(感染后57天) 两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。0分，无肉眼病变+1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。+2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。+3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。+4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分（图17-8）。图17-8柔嫩艾美耳球虫病变记分毒害艾美耳球虫(感染后57天)0分，无肉眼病变+1分，从小肠中部浆膜面看有散在的针尖状出血点或白色斑点，粘膜损伤不明显。+2分，从小肠中部浆膜面看有多量的出血点，也可见到中部肠管稍充气。+3分，小肠腔有大量出血，浆膜面见有红色或白色斑点。粘膜面粗糙，增厚，有许多针尖状出血点。肠内容物含量少；充气达小肠下半段，小肠粗度明显加大但长度明显缩小。+4分，小肠因严重出血而呈暗红色、褐色，大部分肠管气胀明显，粘膜增厚加剧，肠腔内充满血液和粘膜组织的碎片，从浆膜面看，在感染部位组织见到白色或红色病状，在死亡鸡只病灶为白色和黑色，呈“白盐与黑胡椒”之外观，有些情况，可见到寄生性肉芽肿，肠管增粗一倍，长度缩短一倍。死亡鸡只也计+4分（图17-9）。 图17-9 毒害艾美耳球虫病变记分布氏艾美耳球虫(第67天)0分，无肉眼可见病变+1分，仔细观察时疑有病变。+2分，小肠下段增厚，肠壁呈灰色，从其上可剥下橙红色物质。+3分，小肠壁增厚，有带血的卡他性渗出物，直肠段有横向的红色条纹，病变发生在盲肠扁桃体时，有软的粘液栓。+4分，小肠下段可能出现广泛的凝固性坏死。病变可能扩展到小肠中段或上段。部分鸡小肠粘膜面的干性坏死膜可能使小肠出现皱痕以及干酪样盲肠芯。病死鸡也计4分（图17-10）。图17-10 布氏艾美耳球虫病变记分 巨型艾美耳球虫(第67天)0分，无肉眼可见病变。+1分，小肠中段浆膜面隐约可见出血点，肠腔中有少量桔黄色粘液，肠管形状不见异常。+2分，小肠中段浆膜面有多量出血点，肠腔中见有多量桔黄色粘液，肠壁增厚。+3分，小肠充气，壁增厚，粘膜面粗糙，小肠内容物含有小血凝块和粘液。+4分，小肠充气明显，肠壁高度增厚，肠内容物含有大量血凝块和红褐色血液。病死鸡只也计4分（图17-11）。图17-11 巨型艾美耳球虫病变记分堆型艾美耳球虫(第57天)0分，无肉眼可见病变。+1分，十二指肠浆膜面有散在的白色斑，每平方厘米不超过5处。+2分，白色斑增多但不融合，形成白色梯形条纹状外观，3周龄以上的鸡，病变可扩展到十二指肠下20cm，肠壁不增厚，内容物正常。+3分，白色病灶增多且融合成片，小肠壁增厚。内容物呈水样，病变蔓延到卵黄囊憩室之后。+4分，被感染的肠绒毛缩短融合，使十二指肠和小肠粘膜呈灰白色，肠壁高度肥厚，肠内容物呈奶油状。死亡鸡只也计为+4分（图17-12）。图17-12 堆型艾美耳球虫病变记分5鸡球虫感染的粪便记分。 在实验室感染中，粪便记分和病变记分的方法同样可用于对球虫感染程度的判断。划分在0+4内，0分表示粪便正常，+4分表示最严重的腹泻，带有粘液或血液。粪便记分尚未有完整的记分标准系统，索勋(1997)提出，粪便记分反映群体感染球虫后有多少个体表现出粪便性状不正常。对于不具明显拉血的球虫感染，诸如堆型、巨型、布氏、早熟与和缓艾美耳球虫的感染，对给定1224h时间范围内，0分表示100%粪便正常，+1分表示25%的粪便不正常，+2分表示50%的粪便不正常，+3分表示75%的粪便不正常，+4分表示100%的粪便不正常；对于有明显拉血的球虫感染，诸如柔嫩和毒害艾美耳球虫的感染，对给定1224h时间范围内，0分表示100%的粪便不带血，+1分表示25%的粪便带血，+2分表示50%的粪便带血，+3分表示75%的粪便带血，+4分表示100%的粪便带血。四、实验注意事项1.分离不同的卵囊时，实验过程中所用的离心管，洗管，烧杯等器皿需彻底洗净，以防污染。2.卵囊孢子化需要合适的温度和湿度及充足的氧气，最好的培养液是2.5%的重铬酸钾液。培养时，卵囊的密度也不应超过106个/m1，培养液的深度不超过0.7cm。3.在卵囊计数的几种方法中，载玻片的计算方法准确，但费时。血球计数板计算卵囊的方法，虽然简便易行，但在卵囊数量少的情况下，误差较大，可靠性差。而浮游生物计算板的方法，介于前两者之间，具有利用价值。麦克马斯特法方便准确，若所测卵囊数量很多，可酌情稀释后再计数。用铬硫酸卵囊计数时，如果鸡粪中的杂物碎片扰乱视野，可用铬硫酸溶液稀释粪便，溶解杂质。4.鸡球虫感染的病变记分制用于阐述抗球虫药物的效果和球虫疫苗的保护效果时存在相当大的局限性，而且随检测人的不同而有所变化，尤其是重要的球虫种的不同，如巨型艾美耳球虫的感染程度并不总是与肠道眼观病变的严重性相关。5.鸡球虫病是最常见的疾病，但许多诊断者很少注意到肠道寄生的球虫种的鉴别。柔嫩艾美耳球虫寄生于盲肠，比较容易鉴定。球虫种的鉴定需要眼观病理变化和肠粘膜刮取物镜检识别发育阶段虫体二者相结合，所发现的虫体形态需要与7种艾美耳球虫的特征相比较加以识别。五、实验报告1绘制艾美耳属球虫的孢子化卵囊形态图，并标出其结构特征。2阐述一种分离卵囊的方法，并说明该方法的优、缺点。 专心-专注-专业