紫草宁生物合成途径中的代谢与调控(共16页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上紫草宁生物合成途径中的代谢与调控1. 背景知识介绍1.1 紫草及紫草宁紫草（：Lithospermum erythrorhizon），为紫草科紫草属植物。又名山紫草、紫草根，分布于日本、朝鲜以及中国大陆的辽宁、山西、湖南、甘肃、山东、湖北、广西、四川、陕西、贵州、江西、河北、河南等地，生长于海拔50米至2,500米的地区，多生长在山坡草地，目前尚未由人工引种栽培。紫草是一种重要的药用植物，其功效是凉血，活血，解毒透疹。用于血热毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，疮疡，湿疹，水火烫伤。紫草根部富含红色的萘醌类次生代谢产物紫草宁及其衍生物。紫草宁又称紫草素，英文名称：Shikalkin，英文别名：5,8-Dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methylpent-3-enyl)naphthalene-1,4-dione，即5,8-二羟基-2-(1R)-1-羟基-4-甲基戊-3-烯基萘-1,4-二酮，结构式如下：宁为赤褐色针状晶体(由苯重结晶)。熔点149。旋光度-167°±10°(在苯中)。能溶于普通有机溶剂，以及动和碱性水溶液。难溶于碳酸氢碱溶液。与氢氧化碱金属作用显蓝色。由于紫草素具有多种生物学活性，以紫草素为先导化合物开发抗炎、抗肿瘤、抗病毒新药的研究已成为热点课题，除此之外，紫草素还是良好的天然色素，已广泛用于食品、化妆品和印染工业中。1.2紫草宁及其衍生物的药理作用1.2.1 抗肿瘤活性近年来， 紫草次生代谢物的抗肿瘤活性倍受关注。紫草素能够抑制肝癌肿瘤细胞增殖1、 诱导生殖系统肿瘤细胞凋亡2， 并兼具调控机体免疫的功能。紫草素在体外一定浓度范围内能抑制人白血病 562细胞增殖，诱导其凋亡。甲基丙烯酰紫草素具有较好的体内外抗肿瘤作用，作用机制可能与诱导细胞凋亡和抑制 NF-zB p50的活性有关3。乙酰紫草素可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌 SGC-7901细胞在体内外的增殖4。1.2.2 抗炎活性紫草素能有效减轻由中波紫外线（UVB） 引起的表皮角蛋白细胞炎症， 起到保护皮肤的作用；还可以减弱小神经胶质细胞的炎症反应， 达到保护神经系统的作用。1.2.3 降胆固醇活性研究发现， 从硬紫草根部氯仿提取物中分离出的三种化合物乙酰紫草素、 异丁基紫草素和 -羟基异戊酰紫草素均具有抑制人类酰基辅酶-胆固醇酰基转移酶-1和人类酰基辅酶-胆固醇酰基转移酶-2的活性。酰基辅酶-胆固醇酰基转移酶是胆固醇生物合成途径的关键酶，乙酰紫草素、异丁基紫草素和 -羟基异戊酰紫草素通过抑制该酶的活性，从而达到降低胆固醇含量，防治动脉粥样化的目的。紫草的药理作用除了上述内容之外，还有降血糖活性，抗生育、抗免疫缺陷、抗凝血、保肝护肝、抗前列腺素生物合成、抗菌及清除活性氧作用等。1.3紫草及紫草宁的市场紫草是我国传统中药材，多家中药饮片厂以紫草为主要原料研制开发生产了约500多种（规格）中成药、特药、新型中药，以及几十种中药饮片。这些产品投入市场后很受消费者欢迎，销量增加，对紫草的需求量也随之逐年大幅攀升。据不完全统计，紫草需求量2000年为100吨，2002-2004年增长至200-500吨，2005-2007年增长至700-1000吨，2008-2009年又增长至1100-1300吨，2010年已增长至1400吨左右。2010年的市场用量是世纪初叶的14倍，创下历史新高。预测今年市场用量将超过1500吨。然而市场提供的紫草几乎完全是野生品。由于大规模地滥采乱挖，已造成野生资源枯竭，从2001年起野生紫草资源呈逐年减少之势。据不完全统计，2001年野生紫草产量为3000-4000吨左右，2002-2003年下降至1000-1500吨左右，2006年再降至800吨左右，2009-2010年已降至500吨左右。资源的匮乏抬高了紫草及其提取物的价值，在国际市场上，紫草提取物价格高达每公斤7000美元。2. 紫草宁的生物合成2.1植物组织培养技术概念又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 组织培养能够快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物，利用植物组织培养技术培养紫草细胞来得到紫草素，便是成功的例子。2.2紫草宁的生物合成途径紫草素及其衍生物的主要生物合成过程是先由两类重要的代谢， 即苯丙素类代谢和甲羟戊酸代谢分别形成两个重要的中间前体 对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基焦磷酸（GBB）， 然后由对羟基苯甲酸香叶基转移酶催化及其它代谢酶的级联反应合成的。该次生产物最初在内质网中形成，然后通过胞外分泌作用将紫草素微粒运输到细胞壁中5。两个前体物质对羟基苯甲酸（PHB）和香叶基焦磷酸（GBB）的生物合成分别如下67： 苯丙氨酸 丙氨酸脱氨酶（PAL）反式肉桂酸肉桂酸-4-羟化酶（C4H）4-香豆酸4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）4-香豆辅酶APHBOGTPHBOG对羟基苯甲酸（PHB） PHB-O-Glu乙酰辅酶A 乙酰辅酶A硫解酶（AACT）+ HMG-CoA合成酶（HMGS）-羟基，-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA） HMG-CoA还原酶（HMGR）甲羟戊酸（MVA）焦磷酸化、脱羧 IPP 二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），焦磷酸香叶酯合成酶GPP在紫草宁的生物合成过程中，由对羟基苯甲酸香叶基转移酶作用，将甲羟戊酸代谢途径形成的GPP的香叶酯基转移到来自丙氨酸代谢产物PHB上，形成香叶基-对羟基苯甲酸（GBA），该化合物是生成紫草宁及其衍生物的前几部反应中的重要前体，由它经过几步酶联反应便生成目标产物，其完整步骤整理如下（由文献整理所绘）：3. 紫草宁的代谢与调控目前，不但基本清楚了紫草宁生物合成代谢的途径，而且还从紫草培养细胞中分离和鉴定了一些与紫草宁合成相关的代谢酶和基因，开展了紫草宁生物合成的毛状根转基因培养体系以及改变或修饰紫草宁生物合成代谢途径、代谢酶基因等的代谢工程研究。本文将结合这些研究成果，介绍一些与紫草宁生物合成相关的代谢酶和基因的功能和表达特性，以及在实际生产中，是怎样对紫草宁及其次生药物进行生产调控的。3.1 代谢工程概念代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用重组DNA为主的技术，操纵酶的转移和细胞调节功能，定向改造基因组结构，重新设计细胞的代谢系统，达到生物体内改变代谢流，扩展代谢途径和构建新的代谢途径的目的。在植物次生代谢产物的代谢工程中以毛状根转化体系应用较多，离体培养的毛状根中代谢酶基因表达特性和次级产物代谢调控具有与培养细胞基本一致的特点。毛状根培养系统的应用已非常广泛，如：培养长春花毛状根可以生产长春花碱；人参毛状根生产人参皂苷等，不仅如此，这种明显优于植物组织培养的技术也成功运用于紫草宁的生产，即利用紫草毛状根生产紫草宁8。通过Ri质粒的转化获得的紫草毛状根，与紫草植株的根一样能产生和分泌紫草宁色素，且与紫草细胞保持生产调控的一致性，故毛状根为紫草宁代谢工程及开展基因功能和其它分子生物学领域的研究奠定了基础。3.2毛状根毛状根是指整体植株或某一器官、组织（包括愈伤组织）、单个细胞，甚至原生质体受到发根农杆菌的感染所产生的一种病理现象，是细胞中质粒的T-DNA插入寄主细胞核基因组而得到的表现型，主要是在感染部位上或附近能产生大量的副产物-毛状根。目前，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域。在药用植物方面，以发根农杆菌m 质粒转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化生产，来解决中药资源的短缺问题，越来越受到人们的重视。相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定，并能向培养液释放部分代谢产物等优点，通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质，以及原来植物所不含有的活性成分。3.3紫草宁生物合成关键的代谢酶紫草宁生物合成代谢途经中的关键酶已用红笔标出（请见上图）。3.3.1 苯丙氨酸脱氨酶（PAL）苯丙氨酸脱氨酶是苯丙素类代谢途径中的起始代谢酶，它将苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸，PAL基因在植物中以基因家族形式存在，科学家从紫草培养细胞中分离到两个编码PAL的cDNA克隆。这两个基因主要在形成紫草宁的紫草植株的根部表达。光照和茉莉酸甲酯能促进紫草培养细胞中的PAL基因的表达9。3.3.2 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）4-香豆酸辅酶A连接酶也是植物苯丙素类代谢中的重要酶。4CL 将4-香豆酸转换成4-香豆酸辅酶A,该化合物再经不同的代谢途径可以生成木质素、 类黄酮和香豆素等酚类产物, 但在紫草细胞中则形成重要的中间产物PHB。从紫草细胞中分离到该基因的两个cDNA克隆,LE4CL-1和LE4CL-2，光照能显著增加它们的表达水平10。3.3.3 甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）紫草宁的部分碳骨架来自于异戊二烯代谢途径，而HMGR是 代谢途径中起初的反应酶。该酶催化甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为MVA，然后经反应生成另一重要的中间产物GPP（见生物合成途径）。该酶与紫草宁的形成密切相关，是一个重要的调节酶。光照强烈抑制HMGR基因在紫草培养细胞中的表达，因此光照也强烈抑制紫草宁的形成11，可见HMGR基因的表达调控对紫草宁的形成具有重要的调节作用。3.3.4 对羟基苯甲酸香叶基转移酶（PGT）对羟基苯甲酸香叶基转移酶是紫草细胞培养紫草宁形成代谢中的一个至关重要的代谢酶，它将GPP的香叶基转移到PHB上而形成GBA，最终反应生成紫草宁及其衍生物，增加或是减少它的活性直接影响到紫草宁的生产，故在紫草宁形成的调控中起着重要的作用。科学家分离到两个PGT的cDNA克隆，LePGT-1和LePGT-2，这两个基因只在紫草植株根中表达，而且特异地以GPP为代谢底物。寡糖和MeJA能增加培养基中紫草细胞PGT基因表达和PGT活性，而光照却强烈抑制该基因的表达和PGT活性10，以及紫草宁的形成，暗培养则显著增强他们的表达。在紫草培养细胞中, PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草宁的形成具有高度的一致性，可见 PGT 基因的表达水平对紫草宁形成调控的重要性。3.3.5 小结以上四个酶是对紫草宁生物合成代谢影响最大的四个酶。前三个酶PAL、4CL和HMGR作用于两个组成单元（PHB、GBB）的形成，最后一个酶PGT作用于构建单位的连接。这四个酶的活性及其基因表达的强弱都受到光照的影响，我认为是这些基因在光照或避光条件下差异表达的结果。PAL和4CL两个酶在光照条件下能增加其表达水平，但是光照又会强烈抑制HMGR和PGT的活性，如此情况下，采用光照或是遮光培养都会对紫草素的合成产生影响。为研究光照对紫草宁形成的分子机理，科学家采用差减杂交基因克隆技术从紫草细胞中分离了在暗培养条件下优势表达的基因克隆，并证明HMGR和PGT基因的表达模式与其酶活性变化和紫草宁的形成具有高度的一致性，而 PAL和4CL基因的表达和它们酶活性的变化与紫草宁形成的关系没有这样密切。即光照对紫草宁合成的消极作用程度远远大于光照的积极作用，因此应选择暗培养技术。3.4紫草宁的调控策略代谢工程可以通过调节或修饰代谢酶基因、改变代谢途径等方法来调控目的产物的生产。在植物培养细胞中，提高细胞中次级代谢产物的途径，与微生物次级代谢产物的调节有着诸多相似又不同的地方。在植物培养细胞中，主要的提高次级代谢产物含量的方法有：优化培养条件，选择最适的培养条件；增加前体和生物转化；添加诱导子；发状根培养；植物细胞固定化技术和筛选高产细胞系等方法12。下面将介绍在紫草宁的生产调控中，这些方法的具体应用。3.4.1 诱导筛选紫草宁高产细胞系植物细胞培养工业化应用的关键前提之一是必须有一个高产并稳定的细胞系。由于植物培养细胞具有高度的变异性及异质性，因此通过自然筛选或诱变筛选均有可能从中筛选到所需形状的细胞变异系。紫草宁是高品质的染料，颜色鲜亮，可以利用目视法直接从培养细胞中筛选到具高含量色素的细胞系，这是产色素细胞系筛选的独特优势。文献报道的紫草宁细胞系的诱变方法主要有辐射诱变筛选13和农杆菌介导的株系筛选814。据文献记载，经-射线处理后的细胞系紫草素含量较对照组提高了144.6%，证明了射线处理的有效性。而利用发根农杆菌MSU440转化新疆紫草子叶外植体，获得了激素自主、快速生长、多分支、多根毛的毛状根株系，为今后应用生物反应器进行紫草规模化生产奠定了理论基础。3.4.2 改良优化培养基及培养条件3.4.2.1 无机元素的优化在紫草素的合成培养基M9中添加镁、铜、钙、锌等无机元素，得到优化后的培养基M10。M10培养基能够明显促进紫草素及其衍生物的合成和积累15。分析其原因，铜离子可能是紫草素合成途经中某些酶的活性必须；实验研究表明，在紫草细胞的悬浮培养基中，紫草宁的产量随着钙离子螯合剂EGTA浓度的增加而明显减少，6mMEGTA能完全抑制紫草宁的形成。分析原因钙离子是植物细胞信号转导过程的重要的第二信使，紫草细胞中很可能存在一些依赖钙的调节蛋白和功能蛋白，增加钙的含量，使这些钙依赖蛋白的活性得到加强；锌是色氨酸合成酶的必要成份，缺锌时植物细胞不能合成色氨酸，而色氨酸是合成生长素的前体，因此培养过程中缺少锌离子时，可能导致培养基体系中生长素的缺乏，从而影响细胞正长的生理代谢。除了镁离子的促进机制在文献中没有提及外，其他几种离子的作用都不会影响上文提及的紫草宁合成代谢中的几个关键酶基因的表达水平，而是通过自己独特的作用机制对紫草宁的合成产生影响，这是与其他的调控方式不同的地方。3.4.2.2 激素的影响研究发现，某些激素可以促进紫草素的合成。文献中记载的激素有水杨酸和油菜素内酯BR。高浓度的水杨酸可以促进紫草素的合成，其机制为水杨酸可以显著提高PHB-香叶基转移酶的活性， 同时显著降低PHB-葡萄糖基转移酶的活性。由此可以推断水杨酸可能通过调节紫草宁合成过程中的PHB-香叶基转移酶(PGT)的活性和PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)的活性来调控紫草素的生产16。PHB-香叶基转移酶是紫草素合成的关键酶，它的调控作用重要性不言而喻。这里主要分析一下对PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)的调控。PHB-葡萄糖基转移酶(PHBOGT)将中间产物PHB反应生成对葡萄糖-氧-苯甲酸（PHB-O-Glu）（见上PHB的生合成途径），降低了紫草宁合成单位PHB的含量，从而减少紫草宁的合成量。水杨酸能显著降低PHB-葡萄糖基转移酶的活性，维持了合成紫草素所需的PHB浓度，保证了生合成的正常进行。也有文献报道PHBOGT的活性直接受光照而不是内源PHB浓度的调控，白光能诱导增加该酶的活性11，这也说明了选择暗培养方式的正确性。水杨酸处理还提高了苯丙氨酸解氨酶、 过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。这几个酶都是植物抗性反应的几个关键酶，与次生代谢的合成密切相关。水杨酸也可能是通过促进这几个酶活性的升高， 从而促进紫草素合成。BR的作用与水杨酸类似。它也可以显著提高PHB-香叶基转移酶的活性， 同时显著降低PHB-葡糖基转移酶的活性。3.4.2.3 外加物和外加条件的影响文献记载，在培养基中加入一些其他外源物质，可以提高紫草宁的产量，这里称为外加物。他们包括：稀土混合物、乙烯前体、茉莉酮酸甲酯、低浓度多胺等17。这些物质的作用机理不甚清楚，推测为影响了PHB-香叶基转移酶的活性。超声波能够引起新疆紫草细胞的应激反应，并且通过细胞丙氨酸转氨酶的酶活来强化紫草素的生物合成途径，显著提高了紫草素含量和产量18。一定剂量的-射线照射紫草细胞，也可以提高细胞合成紫草素的能力，原因可能是提高了紫草素合成途径中 PHB-香叶基转移酶活性，导致了次生代谢物特别是紫草素的积累19，这也是-射线能够诱变紫草细胞产生高产细胞系的理论基础。3.4.3 应用真菌诱导子真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号，是一类特殊的触发因子。在植物与真菌互作用中，它们可快速、高度专一和选择地诱导植物特定此生产物的合成。米曲霉诱导子是由一些结构相似的组分组成，共同作用促进紫草色素的合成20。一般认为特定结构的诱导子与植物细胞膜上特定受体类蛋白结合，快速并有选择性地诱导特定基因的表达。据文献报道，加入诱导子后，紫草素的含量比对照组增加了230个诱导子相对活性单位。其他的真菌诱导子中，黑曲霉诱导子也可显著提高紫草宁的产量，并可加快胞内色素分泌到培养液中的速率和数量，加诱导子的培养组产紫草宁是对照组的2.24倍。3.4.4 植物细胞固定化近些年,通过固定化细胞培养的方法生产次生代谢物的研究也越来越多。固定化细胞培养加强了细胞之间的接触,有利于细胞进行次生代谢,从而提高产量;同时,固定化有可能使细胞保持休止状态,可以解决植物细胞在悬浮培养中容易变异的问题.用于植物细胞领域的固定化方法有凝胶包埋、吸附、泡沫固定及应用膜反应器等。实验研究证明，对于紫草细胞，吸附固定化的产率结果高于普通悬浮培养3.92倍21。3.4.5 通过基因工程调控紫草素及其衍生物的合成3.4.5.1 改变代谢途径在紫草细胞中, PHB 先由莽草酸和分枝酸途径合成苯丙氨酸, 再经脱氨、羟基化、偶合等苯丙素类代谢途径,约需10个代谢酶的连续催化反应才能形成（见上生物合成图）。然而, 大肠杆菌的ubiC 基因编码产物分枝酸丙酮基裂解酶( chorismate pyruvatelyase , CPL) 可以直接将分枝酸催化生成PHB,并在转 ubiC 基因烟草中表现出了很高的CPL活性 22。在转 ubiC 基因的紫草毛状根中, 同位素示踪和对其内源苯丙素类代谢途径的阻断实验显示了CPL活性并直接合成了PHB,而且也能大量形成紫草宁,从而改变并缩短了紫草细胞中紫草宁形成的代谢途径。分枝酸分枝酸苯丙氨酸 分枝酸丙酮基裂解酶（CPL，大肠杆菌的ubiC 基因编码）反式肉桂酸4-香豆酸对羟基苯甲酸（PHB）4-香豆辅酶A对羟基苯甲酸（PHB） （原代谢途径） （新代谢途径）3.4.5.2 调节或修饰代谢酶基因大肠杆菌中的 ubiA 基因编码的产物具有PGT 相似的功能, 即催化GPP生成重要前体GBA。转 ubiA 基因紫草毛状根中, 表现出了很高的UbiA 代谢酶活性,合成的GBA 大约是对照的50倍,比对照平均增加了22%的紫草宁产量 23。此外, 采用强启动子在紫草细胞中分别强表达了来自大肠杆菌中由 ubiC 基因和来自拟南芥的HMGR基因, 获得的转基因紫草毛状根中分别增加了CPL和HMGR的活性, 但都没有显著提高紫草宁次生产物产量24。从紫草宁代谢工程的研究看来,在获得的转 ubiC、 ubiA 或者HMGR 基因紫草毛状根中,虽然分别增加了个别代谢酶的活性和代谢中间产物的含量, 但都没有显著提高紫草宁生产。可见,在复杂的次生代谢中单个代谢酶活性的改变难以显著提高目标产物的产量,有必要对代谢网络的结构、调控等进行系统研究,才能更好地开展代谢工程。参考文献1 王雪宝，王英丽，张阳，等新疆紫草素抗肝癌的研究中国误诊学杂志，2007，7(16) ：3727-37282 王英丽，张阳，刘力华紫草素诱导生殖系肿瘤细胞凋亡的研究中国妇幼保健，2007，22(25) ： 3585-35873 邵振俊，伍怡颖，郑小卫，等甲基丙烯酰紫草素的抗肿瘤作用及其机制的研究华西药学杂志，2009，24(3)：242-243.4Zeng Y, Liu G, Zhou L M. 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