倒置荧光显微镜（Olympus IX53）标准操作规程.doc

临床输血质量管理体系技术性规程文件编号版本/修改状态B/0共 5 页编制者审核者批准者发布日期2022.04.01实施日期2022.04.01倒置荧光显微镜（Olympus IX53）标准操作规程1.目的为规范倒置荧光显微镜（Olympus IX53）的技术操作，确保该仪器的正确使用，依据输血实验室管理程序的要求制定本规程。2.使用范围适用于输血科技术人员规范使用倒置荧光显微镜（Olympus IX53）的技术操作。3.职责输血科技术人员负责倒置荧光显微镜（Olympus IX53）的操作。4. 原理（略）5.标本要求（略）6.所需设备、耗材与试剂（略）7.检测环境条件应将显微镜置于无振动，避免有粉尘的环境中。室温应控制在5-40，湿度应80%。8. 操作步骤及方法8.1 仪器部件如下所示说明：透射光主开关；汞灯高压电源开关；透射光光强控制钮；滤色片架；光路选择杆；X轴和Y轴调节钮；物镜转盘；粗/微调焦旋钮；双目观察筒；屈光度调节环；聚光镜高度调节钮；聚光镜对中旋钮；视场光阑调节杆；孔径光阑调节杆；聚光镜转盘；荧光光闸（SHUTTER）；荧光激发块转盘；荧光减光阀。8.2 开机8.2.1 打开透射光源（白光）主开关；8.2.2 打开荧光光源（汞灯高压电源）；8.2.3 打开电脑，进入cellSens Standard工作站； 备注：标本为HE染色、免疫组化时，不需要打开荧光光源；标本为荧光染料染色时，一般也不需要打开白光光源。8.3 明场观察（Bright Field BF）8.3.1 正确放置标本，BF主要用于HE染色、免疫组化标本；8.3.2 转动荧光激发块转盘到“6”的位置；8.3.3 转动聚光镜转盘到“BF”位置，直到听到咔嗒声；8.3.4 将光路选择杆推进去（ 选择目镜观察光路）；8.3.5 转动物镜转盘，选用合适的物镜，调节白光光强控制钮至合适的强度，调节粗/细调焦旋钮聚焦观察,根据需要调节瞳间距和屈光度；8.4 相衬观察（Phase contrast PH)8.4.1 正确放置标本，PH主要用于没有任何染色的、较透明的标本；8.4.2 转动荧光激发块转盘到“6”的位置；8.4.3 转动物镜转盘，选用合适的物镜；8.4.4 转动聚光镜转盘，使相衬光学元件与所用物镜相匹配（见表1）；8.4.5 将光路选择杆推进去（ 选择目镜观察光路）；8.4.6调节光强控制钮直至合适的强度，调节粗/细调焦旋钮进行聚焦观察,根据需要调节瞳间距和屈光度。 表1： 物镜、相差元件匹配表物镜4X10X、20X40X相差元件PHLPH 1（PH C）PH 28.5 荧光观察8.5.1 如果需要，可先用明场观察对标本定位，再转入荧光观察；8.5.2 如果不再需要BF观察，可关闭白光电源；或将白光光强调节钮逆时针旋至最低，将孔径光阑向右拨至最小；8.5.3 转动荧光激发块转盘，根据所用的荧光染料选择匹配的荧光激发块； 表2：荧光激发块序号激发块名称激发光（nm）发射光（nm）滤掉光（nm）1WU330-3854204002WB450-4805155003WG510-5505905704WBV400-4404754555WIY545-5806106006BF明场、相差8.5.4 打开荧光光闸（SHUTTER），使其置于“O”位置； 8.5.5 将光路选择杆推进去（ 选择目镜观察光路）；8.5.6转动物镜转盘，选用合适的物镜，调节粗/细调焦旋钮聚焦观察，根据荧光强度选择合适的ND滤镜（荧光减光阀）进入光路。（第一个ND100：100%的荧光强度进入光路；第二个ND6：6%的荧光强度进入光路，第三个ND25: 25%的荧光强度进入光路）。8.6 CCD成像8.6.1 cellSens Standard工作站中，点击右侧摄像控制中的实时观察；8.6.2 将光路选择杆拉出（，CCD成像光路），调节粗/细调焦旋钮进行聚焦；8.6.3 曝光：可先选择自动曝光，参照自动曝光时间，再通过手动调节曝光时间使图像更清晰；8.6.4 背景校准：进行明场和相差成像时执行白平衡 ，荧光成像时执行黑平衡， 在样品空白背景处画一个小区域，软件自动以该处为背景对整幅图像进行调整，使所选区域显示为白色或黑色；8.6.5 各成像参数设定完毕后，点击拍照 ，仪器自动成像；8.6.6 右键文档工具栏窗口或在文件处进行保存（TIF或JPG格式）。8.7 图像处理8.7.1 标尺：在工具栏上选择正确的物镜倍数，点击“视图”-标尺，软件自动将标尺加在图像上，再点击“图像”-印入信息，保存即可。8.7.2 测量：点击“测量”-测量工具，软件左侧显示出测量工具栏，点击选择所需的测量工具，在图像上画目标区域，右键点击结束测量即可显示结果。 测量结果可导出Excel：点击测量工具栏图标 。8.7.3 图像叠加：打开拟叠加的图，“图像”-组合彩色图像-“可用图像”中选择拟叠加的图-合并层-确认。8.7.4 图像拼接：按一定顺序 拍摄图像，相邻两张图像的边缘要部分重叠，所有图像拍摄完毕后，选择视图-工具-画廊-全选拟拼接的图像，选择运算-图像拼接-设置水平方向图像数量-根据拍摄顺序摆好图像位置-确定；预览后视情况选择“裁剪边缘”-确定。8.8 关机8.8.1 关机前请查看放在实验台上的刷卡机“日历”，如紧接着有其他人员将使用该仪器，无需关机，联系后面使用者。8.8.2 实验完毕，先退出工作站；8.8.3 将透射光光强调节钮逆时针旋至最低，关闭透射光主开关（TH4）；8.8.4 确认汞灯开启超过0.5h，方能关闭汞灯高压电源；8.8.5 用无水乙醇擦拭镜头，并将物镜转盘转至空位，清理载物台及桌面；8.8.6 数据上传：将待上传的实验结果文件夹添加为压缩包，再将其复制到桌面上的“云存储文件夹”中。8.8.7 关电脑及显示器。9.结果判读与报告（略）10.质量控制（略）11.注意事项11.1 汞灯开启后必须至少使用0.5h才能关闭！汞灯关闭后若还需使用，必须等0.5h后才能再次开启！11.2 软件上如果没有显示“摄像控制”，通过以下方式调出：视图-工具窗口-摄像控制。11.3 在使用20X和40X物镜时，如不能清晰聚焦，先检查玻片是否清洁，放置是否正确，再边转动物镜上的校正环，边聚焦，找到最佳校正位置。12.支持性文件12.1 IX53倒置荧光显微镜使用说明书13.相关表单（略）