生物化学核酸的结构与功能课件.ppt

主主 要要 内内 容容n第一节第一节 核酸的化学组成及其一级结构核酸的化学组成及其一级结构n第二节第二节 DNA的空间结构与功能的空间结构与功能n第三节第三节 RNA的结构与功能的结构与功能n第四节第四节 核酸的理化性质核酸的理化性质n第五节第五节 核酸酶核酸酶第一节第一节核酸的化学组成及其一级结构核酸的化学组成及其一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acidn核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分子，携带和传递遗传信息。核酸是遗传信息的载体核酸是遗传信息的载体(Appendix 1：)l1868年年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取核素。从脓细胞中提取核素。 l1944年年 Avery等人证实等人证实DNA是遗传物质。是遗传物质。l1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构。的双螺旋结构。l1968年年 Nirenberg发现遗传密码。发现遗传密码。l1975年年 Temin和和Baltimore发发现逆转录酶。现逆转录酶。l1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA测序方法。测序方法。l1985年年 Mullis发明发明PCR技术。技术。l1990年年 美国启动人类基因组计划美国启动人类基因组计划(HGP)。l1994年年 中国人类基因组计划启动。中国人类基因组计划启动。l2001年年 美英等国完成人类基因组计划。美英等国完成人类基因组计划。n核酸研究的发展简史核酸研究的发展简史n核酸的分类及分布核酸的分类及分布存在存在于细胞核和于细胞核和线粒体线粒体 分布于细胞核、细胞质、分布于细胞核、细胞质、线粒体线粒体(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，并通过复制传递携带遗传信息，并通过复制传递给下一代。给下一代。是是DNA转录的产物，参与遗传信转录的产物，参与遗传信息的复制与表达。某些病毒息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体也可作为遗传信息的载体一、核酸分子（一、核酸分子（DNA和和RNA）的化学组成）的化学组成 Nucleic Acid (NA) Polynucleotide chain (poly Nt)Nucleotide (Nt) basic unitMono-phosphate (Mp)Nucleoside (Ns)Deoxy-ribose ( Ribose )BasePurin (pu) Pyrimidine (py)Adenine (A) Thymine (T) Guanine (G) Uracil (U) Cytosine (C) DNA与与RNA结构相似，结构相似，但在组成成份上略有不同。但在组成成份上略有不同。核酸（核酸（DNA和和RNA）是一种线性多聚核是一种线性多聚核苷酸，它的基本结苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。构单元是核苷酸。核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸（脱氧）核苷（脱氧）核苷戊糖戊糖碱基碱基脱氧核糖（核糖）脱氧核糖（核糖）嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶n分子组成分子组成碱基碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖：核糖，脱氧核糖磷酸磷酸(phosphate)核苷酸是构成核酸的基本组成单位核苷酸是构成核酸的基本组成单位碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶存在于存在于DNA和和RNA中中仅存在于仅存在于RNA中中仅存在于仅存在于DNA中中碱基碱基(base)是含氮的杂环化合物。是含氮的杂环化合物。n碱基碱基嘌呤嘌呤(purine，Pu) NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)NNH132456嘧啶嘧啶(pyrimidine，Py)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)NHNHOOCH3仅存在于仅存在于RNA中中仅存在于仅存在于DNA中中D-2-脱氧核糖脱氧核糖D-核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)（构成（构成DNA）核糖核糖(ribose)（构成（构成RNA）n戊糖戊糖嘌呤嘌呤N-9或嘧啶或嘧啶N-1与（脱氧）与（脱氧）核糖核糖C-1 通过通过-N-糖苷键相连形成糖苷键相连形成 （脱氧）（脱氧） 核苷核苷(deoxy)ribonucleosiden（脱氧）核苷（脱氧）核苷NNNN9N H2O(O)HOHHHHCH2OHH12糖苷键糖苷键n核苷酸核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OO HO HHHHCH2H1 2OPO-HOO糖苷键糖苷键酯键酯键核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。n核苷酸核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OO HO HHHHCH2H1 2OPO-HOO糖苷键糖苷键酯键酯键n多磷酸核苷酸多磷酸核苷酸环化核苷酸：环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信，是细胞信号转导中的第二信使。号转导中的第二信使。NOCH2OOHONNNNH2POOHcAMPn核苷酸衍生物核苷酸衍生物Adenine Nucleotides Are Components of Many Enzyme CofactorsCoenzyme A (CoA) functions in acyl group transfer reactions.二、二、DNA是脱氧核苷酸通过是脱氧核苷酸通过3,5-磷酸磷酸二酯键连接形成的大分子二酯键连接形成的大分子一个脱氧核苷酸一个脱氧核苷酸3 的的羟基与另一个核苷酸羟基与另一个核苷酸5 的的 - 磷 酸 基 团 缩 合 形 成 磷 酸 二 酯 键磷 酸 基 团 缩 合 形 成 磷 酸 二 酯 键(phosphodiester bond)。 多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷酸酸(polydeoxynucleotide)，即，即DNA链。链。5-末端末端3-末端末端CGA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键交替的磷酸基团和戊交替的磷酸基团和戊糖构成了糖构成了DNA的骨架的骨架 (backbone)。DNA链的方向是链的方向是5 3 三、三、RNA也是具有也是具有3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键的线性大分子的线性大分子 RNA也是多个核苷酸分子通过酯化反应形也是多个核苷酸分子通过酯化反应形成的线性大分子，并且具有方向性；成的线性大分子，并且具有方向性； RNA的戊糖是核糖；的戊糖是核糖； RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。n定义定义核酸中核苷酸的排核酸中核苷酸的排列顺序。列顺序。由于核苷酸间的差由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所异主要是碱基不同，所以也称为以也称为碱基序列碱基序列。5端端3端端CGA四、核酸的一级结构是四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序核苷酸的排列顺序DNA一级结构：核苷酸排列顺序一级结构：核苷酸排列顺序 组成：4种dNMP（ dAMP，dGMP，dCMP，dTMP ） 连接方式：3,5-磷酸二酯键连接5-ACGTA-3,ACGTA, 或或5 pApCpGpTpA-OH 3 形态： 4种dNMP排列为特定的多核苷酸长链n书写方法：书写方法： 核酸分子大小表示：碱基核酸分子大小表示：碱基 (base或或kilobase)数目。数目。l 小 的 核 酸 片 段小 的 核 酸 片 段 ( 80)。rRNA与核蛋白体蛋白结合组成核蛋白体与核蛋白体蛋白结合组成核蛋白体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。，为蛋白质的合成提供场所。三、以三、以rRNA为组分的核蛋白体是为组分的核蛋白体是蛋白质合成的场所蛋白质合成的场所n核蛋白体的组成核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%70S ribosome50S large subunit23S rRNA5S rRNA31 proteins16S rRNA21 proteins30S small subunitn大肠杆菌的核蛋白体大肠杆菌的核蛋白体n18S rRNA的二级结构的二级结构n蛋白质合成时形成的复合体蛋白质合成时形成的复合体RNA组学是研究细胞内组学是研究细胞内snmRNA的种类、结的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时空状态下同一细胞在不同时空状态下snmRNAs表达表达谱的变化，以及与功能之间的关系。谱的变化，以及与功能之间的关系。 四、四、snmRNA参与了基因表达的调控参与了基因表达的调控细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 nsnmRNAsl核内小核内小RNAl核仁小核仁小RNAl胞质小胞质小RNAl催化性小催化性小RNAl小片段干涉小片段干涉 RNA 参与参与hnRNA的加工剪接的加工剪接nsnmRNAs的种类的种类nsnmRNAs的功能的功能n核酶核酶某些小某些小RNA分子具有催化特定分子具有催化特定RNA降解降解的活性，这种具有催化作用的小的活性，这种具有催化作用的小RNA亦被称亦被称为核酶为核酶(ribozyme)或催化性或催化性RNA(catalytic RNA)。 siRNA是生物宿主对外源侵入的基因表达的是生物宿主对外源侵入的基因表达的双链双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段核酸序列的小片段RNA。siRNA可以与外源基因表达的可以与外源基因表达的mRNA相结合，相结合，并诱发这些并诱发这些mRNA的降解。的降解。 基于此机理，人们发明了基于此机理，人们发明了RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi)技术。技术。n小片段干扰小片段干扰RNAn原核生物基因表达的特异性原核生物基因表达的特异性五、核酸在真核细胞和原核细胞中五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性表现了不同的时空特性n真核生物基因表达的特异性真核生物基因表达的特异性小小 结结DNA为双链结构，RNA的结构以单链为主。DNA的二级结构为双螺旋结构。mRNA、tRNA、rRNA结构特点与功能。 核酸的理化性质核酸的理化性质The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid第四节第四节核酸的酸碱及溶解度性质核酸的酸碱及溶解度性质l核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸为多元酸，具有较强的酸性。l可用电泳或离子交换（色谱）进行分离可用电泳或离子交换（色谱）进行分离核酸的高分子性质核酸的高分子性质l粘度：粘度：DNARNA dsDNA ssDNAl线性大分子（粘度高线性大分子（粘度高, 抗剪切力差）抗剪切力差）l沉降行为沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的不同构象的核酸分子的沉降的速率有很大差异，这是超速离心法提取和速率有很大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。纯化核酸的理论基础。核酸的一般理化性质核酸的一般理化性质（在中性溶液中带负电荷），（在中性溶液中带负电荷），核酸在波长核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。核酸的定性和定量分析。一、核酸分子具有强烈的紫外吸收一、核酸分子具有强烈的紫外吸收 以以A260/A280进行定性、定量进行定性、定量 DNA和和RNA溶液中加入溴化乙溶液中加入溴化乙锭锭(EB)，在紫外下发出荧光，在紫外下发出荧光n碱基的紫外吸收光谱碱基的紫外吸收光谱DNA或或RNA的定量的定量A260 = 1.0 相当于相当于 50g/ml 双链双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链单链DNA (ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸寡核苷酸确定样品中核酸的纯度确定样品中核酸的纯度 纯纯 DNA: A260/A280 = 1.8纯纯 RNA: A260/A280 = 2.0n紫外吸收的应用紫外吸收的应用二、二、DNA变性是双链解离为单链的过程变性是双链解离为单链的过程在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链的过程。开成两条单链的过程。n定义定义DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。变性的本质是双链间氢键的断裂。协同性的协同性的DNA解链解链高温或极端的高温或极端的pHnDNA的变性的变性核酸变性与蛋白质变性的本质一样，只涉及自身空间结构的变化，核酸变性与蛋白质变性的本质一样，只涉及自身空间结构的变化，而不改变本身一级结构。而不改变本身一级结构。n部分变性部分变性DNA的电镜图像的电镜图像增色效应增色效应(hyperchromic effect)：DNA变变性时其溶液性时其溶液OD260增高的现象。增高的现象。nDNA解链时的紫外吸收变化解链时的紫外吸收变化Thermal denaturation of double-stranded DNA and RNA.Increases: 2540%.Increases: 1.1%nDNA的解链曲线的解链曲线连续加热连续加热DNA的的过程中以温度相对于过程中以温度相对于A260值作图，所得的值作图，所得的曲线称为解链曲线。曲线称为解链曲线。 解链过程中，紫外解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应变化值的一半时所对应的温度。的温度。解链温度解链温度(melting temperature，Tm) G+C 含量越高，含量越高，解链温度就越高。解链温度就越高。n解链曲线的变化解链曲线的变化Tm vs GC ContentFormula for Evaluation GC% of DNA:（G+C）%=(Tm-69.3)X2.44Marmur-Doty formula（马默多蒂关系式）（马默多蒂关系式） 60 70 80 90 100 110G + C (% of total nucleotides)Tm (oC)100806040200Marmur-Doty formula（马默多蒂关系式）（马默多蒂关系式） 69.3Tm vs GC Content三、变性的核酸可以复性或形成三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链杂交双链当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为象称为DNA复性复性(renaturation) 。减色效应：减色效应：DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火过程称为退火(annealing) 。减色效应hypochromic effectRenaturation of DNA by fast and slow cooling.将热变性的将热变性的DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的不可能复性。变性的DNA缓慢缓慢冷却时可复性，因此又称为冷却时可复性，因此又称为“退火退火”。 退火温度退火温度Tm25一般地, DNA复性最优温度为：Tm -25Nucleation 成核现象成核现象, 晶核形成晶核形成 不同种类的不同种类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一溶分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形成，之间形成，也可以在也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。n核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization) n核酸分子杂交核酸分子杂交Hybrid 杂交体hybrid duplex 杂化双链 研究研究DNA分子中某一种基因的位置。分子中某一种基因的位置。 监定两种核酸分子间的序列相似性。监定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。检测某些专一序列在待检样品中存在与否。n核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用第五节第五节 核酸酶核酸酶 Nuclease依据底物不同分类依据底物不同分类DNA酶酶(deoxyribonuclease, DNase)：专一降解专一降解DNA。RNA酶酶 (ribonuclease, RNase)：专一降解专一降解RNA。依据切割部位不同依据切割部位不同核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶。核酸外切酶。核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。5533外切位点外切位点外切位点外切位点内切位点内切位点内切位点内切位点 参与参与DNA的合成、修复以及的合成、修复以及RNA的剪接。的剪接。 清除多余的、结构和功能异常的核酸，以及清除多余的、结构和功能异常的核酸，以及侵入细胞的外源性核酸。侵入细胞的外源性核酸。 降解食物中的核酸。降解食物中的核酸。 体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 。n核酸酶的功能核酸酶的功能*核酶（核酶（ribozyme） 核核 酶酶u 催化性催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 u 催化性催化性RNA (ribozyme) 作为序列特异性的作为序列特异性的核酸内切酶降解核酸内切酶降解mRNA。 本章总结本章总结核酸包括DNA和RNA。DNA携带遗传信息，RNA参与遗传信息的复制与表达。核酸的基本组成单位是核苷酸。核酸的基本结构。DNA为双链结构，RNA的结构以单链为主。DNA的二级结构为双螺旋结构。mRNA、tRNA、rRNA结构特点与功能。DNA的理化性质。 思考题思考题核酸分子的化学组成 ？DNA与RNA结构化学组成上的主要区别是什么？DNA 的一级结构、二级结构及高级结构的定义？多聚核苷酸是通过什么方式将核苷酸相连而成的链状聚合物？DNA双螺旋结构的要点？（作业）影响双螺旋结构稳定性的主要因素 ？三种主要的RNA及其功能?DNA变性、核酸分子杂交，DNA的Tm值与其所含的G+C比例的关系？核酶的本质是什么？DNA 是主要的遗传物质是主要的遗传物质RNA 也是遗传物质也是遗传物质-烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV） Protein? Prion?蛋白质可以自我复制？可以遗传？蛋白质可以自我复制？可以遗传？DNA 是遗传物质是遗传物质(Appendix 1：)证明证明DNA 是遗传物质的两大经典实验：是遗传物质的两大经典实验：实验一：实验一：1944 年，Avery的经典试验证明细菌的遗传物质为DNA实验二：实验二：1952 年，Hershey和Chase的经典试验证明T2噬菌体的遗传物质为DNANeither heat-killed S-type nor live R-type bacteria can kill mice, but simultaneous injection of both can kill mice just as effectively as the live S-type.实验一：细菌转化过程的核心是实验一：细菌转化过程的核心是DNAThe DNA of S-type bacteria can transform R-type bacteria into the same S-type.转化过程的转化过程的核心是核心是DNAThe genetic material of phage T2 is DNA.实验二：实验二： T2 噬菌体的噬菌体的遗传物质被遗传物质被证明是证明是DNAT2 噬菌体的遗传物质被噬菌体的遗传物质被证明是证明是DNA(捣碎实验捣碎实验)。Eukaryotic cells can acquire a new phenotype as the result of transfection by added DNA.附：附：实验三：外加实验三：外加DNA使真核使真核细胞获得了新的细胞获得了新的表型表型通过外加通过外加DNA，真核细胞，真核细胞获得了新的表型。获得了新的表型。注：由于历史的原因，在真注：由于历史的原因，在真核生物中操作这样的试验被核生物中操作这样的试验被称为转染称为转染(Transfection)，与细菌的转化相对应。与细菌的转化相对应。l 已知生物及大多数病毒中的遗传物质是已知生物及大多数病毒中的遗传物质是DNA。l 但是，有些病毒使用代替的核酸一但是，有些病毒使用代替的核酸一RNA作位遗作位遗传物质。传物质。(尽管它的化学结构与尽管它的化学结构与DNA有一些细微有一些细微的不同，但的不同，但RNA能起到同样的作用。能起到同样的作用。)l 因此，遗传物质的本质是核酸。事实上，除了因此，遗传物质的本质是核酸。事实上，除了RNA 病毒以外，其遗传物质是病毒以外，其遗传物质是DNA。小结：主要遗传物质是小结：主要遗传物质是DNA