[植物抗虫基因工程的研究进展] 基因工程的最新研究进展.docx

植物抗虫基因工程的研究进展 基因工程的最新研究进展植物抗虫基因工程的探讨进展摘要 概述了目前应用于植物抗虫基因工程的两类主要基因，即苏云金杆菌毒蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因的分类、杀虫机理以及基因改造后应用于抗虫基因工程的探讨近况，同时探讨了抗虫基因工程存在问题及解决途径，提出了今后可能的发展方向。关键字 植物 抗虫 基因工程前言虫害是制约农作物高产的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。化学农药的施用在削减虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。而通过基因工程手段培育抗虫新品种 (系)可从根本上解决问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染，具有广袤的应用前景。目前全世界最常改良的性状中抗虫占其次位(24%)，到19101年已商业化的6类性状中抗虫占15%，抗虫和抗除草剂占10%。人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发觉并分别到很多抗虫基因，有很多抗虫转基因植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。迄今发觉并应用于提高植物抗虫性的基因主要有两类:一类是从细菌中分别出来的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因(Bt基因)、异戊基转移酶基因(ipt)，另一类是从植物中分别出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因(PI基因)、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中Bt基因和PI基因在农业上利用最广，本文对这两类基因的转基因工程探讨作一简要综述。1、Bt毒蛋白基因1l Bt毒蛋白的杀虫机理Bt是苏云金杆菌Baciius thuringiensis的简称，是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。通过克隆技术确定Bt基因位于30150MD大小不同的质粒上，其中毒性区间位于该序列N端29607个编码区，C端有高度的保守性，对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。Bt杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或苏云金杆菌毒蛋白(Bt toxic protein)，其中应用于农业生产的主要是内毒素。已知内毒素为130160KD的多肽，在伴孢晶体内是以原毒素(protoxin)的形式存在，经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成5570KD或更小的多肽，与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞 (brushborder membrance)上的特异受体位点结合，引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀死昆虫。12 Bt霉蛋白基因分类自1901年发觉苏云金杆菌以来，现已分别出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形态也不一样。依据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字I、II、III、IV等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下依据氨基酸序列的同源性，又分为A，B，C等不同的基因型。在同一基因型下依据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a，b，c等不同的基因亚型。其分类如下:cry I基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白，约30140KD，在昆虫中肠内降解为6070KD的多肽，在cry I基因间，氨基酸同源性为82%90%的归为cry I A;55%71%的归为cry I A基因中，依据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为:cry I A (a)，4.50kb;cry I A (b)，5.30kb;cry I A (c)，6.60kb亚类基因。Cry II基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白，约65KD。而cry II B只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达80%左右。cry III基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体，约73KD。Cry III A基因与cry I和cryIV基因的毒性核心5" 端编码区有同源性，与3"端编码区有所不同，假如将3"端去掉，将失去杀虫活性。Cry IV基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭园形伴孢晶体。cry IV A，135KD;cry IV B，128KD;cry IV C，78KD;cry IV D，73KD，cry IV A和cry IV B基因在结构上与cry I相像，毒性核心区段为5378KD，位于原毒素蛋白的N端。13 Bt毒蛋白基因的修饰、改造及应用虽然早期的转抗虫基因植物或多或少都对昆虫有些抗性，但杀虫蛋白在植株上的表达量很低 (占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗虫效果不志向。其主要缘由是目前运用的杀虫晶体蛋白大多来源于细菌，与高等植物结构基因正常的DNA序列相比，Bt基因含有较多的AT碱基和ATTTA重复序列。AT富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子，ATTTA重复序列的mRNA的稳定性差，二者都不能在高等植物中编码。此外，Bt基因中的偏爱密码子与植物中的不同，以及共中存在的一些不稳定元件如poly(A)信号序列、切割序列、终止序列等都干脆影响着Bt基因在植物中的mRNA特性。为此，Monsanto公司从两条途径对原基因进行了改造。第一条途径是改进Ti质粒转化载体的启动子，加入带有SV40复制增加子区的35S启动子或重复的强化表达区 (duplicated enhanced region)，发觉改建后的载体表达量比原先提高了510倍 (Perlak等，11010)。其次条途径是依据植物偏爱的密码子对野生型(WT)Bt基因cry I A(b)进行部分改造或人工全合成，Perlak等对WT cryIA(b)AT富含区进行点突变，变更其中63个碱基对，AT含量由63%下降至59%，而ATTTA重复序列也从13个削减至7个，部分改造后的基因称为PMcryIA(b)。PMcryIA(b)基因在转化的烟草和番茄中的表达量为1l0ng/50ug植物可溶总蛋白，比WTcryIA(b)在转基因植物中的表达量(<1ng/50ug)提高了10倍。进一步在不变更编码的氨基酸序列的前提下，几乎更换掉WT基因中的全部不稳定元件，同时尽可能将其中的密码子换成植物优化密码子，AT含量下降至51%，去掉全部ATTTA序列。全合成的基因称为Fncry I A(b)用其转化烟草 番茄，10%以上的转化植株表达量达30-101n/50ug植物可溶总蛋白，最高的可达101150ng/50ug，比WtcryIA(b)的表达量提高50101倍，表现较强的杀虫效果。2、蛋白酶抑制剂基因（PI基因）PI是自然界最为丰富的蛋白质之一，存在于绝大多数生物体尤其是很多植物的贮藏器官，如种子和块茎中，是一类自然的抗虫物质，与前述苏云金杆菌相比，具有抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等优点（Gatehouse,11018）。在植物界，现已发觉近10个蛋白酶抑制剂家族，与抗虫基因工程关系最亲密、探讨最深化的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，基中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。因为绝大多数昆虫所利用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微。PI同昆虫消化道内的蛋白消化酶形成复合物，阻断或减弱蛋白酶的水解形成复合物，阻断或减弱蛋白酶的水解作用，使昆虫厌食或消化不良致死，从而达到抗虫目的。目前已从豇豆、马铃薯、番茄、大豆、玉米等植物中分别纯化出多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA克隆。主要有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI基因）、马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（PTI基因）、玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI基因）以及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（SKTI基因）等。比较不同来源的各种蛋白酶抑制剂，发觉CpTI抗虫效果较为志向，其抗虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎全部昆虫都有杀伤作用，而且其作用位点在酶的活性中心，突变的可能性小，昆虫产生抗性突变的可能性几乎没有，目前已应用于抗虫烟草、水稻、大豆，但由于其表达实力不够强，应用短暂受到限制。19101年高越峰、朱祯等人从未成熟的大豆子叶中分别出SKTI基因，为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶活性，尤其对鳞翅目昆虫有较强抑制作用，且SKTI对胰蛋白酶活性的抑制实力明显高于CpTI，显示出较好的应用前景。3、抗虫基因工程潜在的问题、解决途径及展望伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。首先是昆虫对Bt毒蛋白产生抗性的问题。缘由之一：依据Bt毒蛋白的杀虫机理，在长期选择压力下，昆虫纹缘膜细胞上的受体位点会发生变更，使晶体蛋白不能与纹缘膜细胞上的受体位点结合，失去毒杀作用，结果昆虫就产生抗生。为此，可以实行以下策略，(1)将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因;如具有广谱抗虫特点的CpTI基因以及其他多肽毒素基因结合Bt基因转化植物来抑制昆虫产生抗性。(2)采纳诱导型或组织特异性表达的启动子与Bt毒蛋白基因构成嵌合基因，获得特异性表达的抗虫品种。使Bt基因只在害虫侵害时或者只在植物易受害虫侵害的部位或者只在肯定的条件下 (如化学调整剂)高效表达，以削减耐受性昆虫 的发展。(3)把高剂量表达的转基因植物与非转基因植物混合播种，使在Bt植株上具有纯合抗性基因的抗性昆虫与非转基因植物内易感昆虫交配，它们的后代成为杂合体，这样可以去除昆虫产生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆虫群体中固定。缘由之二：Bt毒蛋白的抗虫谱较窄，某一特定的毒蛋白只对某一种或几种害虫具有毒杀作用，害虫易对其产生抗性。对此可同时运用两个以上的Bt毒蛋白基因转化植物。不同的Bt毒蛋白，依据与竺定昆虫中肠纹缘膜细胞不同受体位点的结合程度，分为竞争性结合 (competitively binding)和非竞争性结合 (noncompetitively binding)蛋白，假如两种晶体蛋白竞争结合昆虫中肠全部受体位点，就称为竞争性结合毒蛋白;假如与第一种毒蛋白结合的受体中有一个或多个不为其次种蛋白所竞争，反之亦然，那么，对该昆虫来说，这两上毒蛋白都是非竞争的。将编码非竞争性结合毒蛋白的2个或2个以上基因同时导入植物，能在很大程度上延缓害虫所产生的抗性。其次个问题是目前Bt毒蛋白基因在转基因植物体中的表达水平普遍较低，存在基因“缄默”和甲基化现象，不能有效地毒杀害虫。基因缄默与目的基因在受体植物中的甲基化状况、拷贝数、插入受体染色体位点及是否与受体植物中有同源基因等因素有关。目前主要实行以下措施来克服基因缄默现象；(1)避开多拷贝外源基因整合到受体基因组中，如利用Ac/Ds转化载体、双元细菌人造染色体载体、构建核基质支架附着区载体系统。(2)用具有特别功能的启动子与增加子调控。(3)在有性世代后代中筛选单拷贝转基因个体。（4）接着深化探讨DNA的空间结构以及各种调控因子和环境因子对转基因的影响。Jaquet等分析至少有三种因素影响杀虫活性:毒素的来源、晶体的溶解性和昆虫对毒素的内在敏感性，昆虫对毒素的 内在敏感性至少还与中肠液pH、蛋白酶活性和毒素受体的类型、数量有关。Bt毒蛋白有134个亚类，它们一级结构的差异以及昆虫中肠上皮细胞上的受体是影响杀虫晶体蛋白毒力和杀虫特异性的两个重要因素。随着转基因缄默机理探讨的不断深化，这种现象最终必将会得到克服。抗虫植物基因工程是一项应用性极强的探讨，它使短时间内培育出抗虫品种成为可能。同时正在进行田间试验的性状中，多基因抗虫性状也屡次出现，将Bt基因、特别的抗病基因、抗除草剂基因及优良品质基因集聚于同一品种。信任不久的将来，会有越来越多的多基因抗虫品种问世。参考文献:1、植物基因工程 主编：王关林 科学出版社 2002-082、基因和基因工程 主编：舒惠国著 科学出版社 2003-04 第10页 共10页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页