流式细胞仪原理及试剂销售培训.ppt
流式细胞仪原理及试剂销售培训流式细胞仪原理及试剂销售培训 流式细胞仪的基本原理流式细胞仪的基本原理流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念v流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, , 简称简称FCM）是）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选量的技术，同时可以对特定群体加以分选v研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等人工合成微球等v研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量并加以定量流式细胞术的特点流式细胞术的特点v极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 v可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。v定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 v强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核的特核的特异性抗原异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC, Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALS SensorFSC信号信号SSC信号信号外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）（红细胞溶解后）Side ScatterForward Scatter流式细胞仪的检测的荧光信号流式细胞仪的检测的荧光信号荧光信号荧光信号u使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析u荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量FITCPE-Cy5PE荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色CD3-FITCCD19-PE数据分析数据分析=数据显示数据显示: : 直方图 ( Histogram )二维点图(Dot Plot)等高线图(Contour Plot)密度图 (Density)三维图（3D Plot）等数据分析数据分析=单参数直方图分析单参数直方图分析PI - Fluorescence# Events正常正常G0/G1G0/G1期细胞期细胞凋亡细胞峰凋亡细胞峰数据分析数据分析=双参数点图分析双参数点图分析五光十色的荧光素五光十色的荧光素u单分子荧光素单分子荧光素u耦合的复合荧光素分子耦合的复合荧光素分子u新型的荧光素样荧光物质新型的荧光素样荧光物质Qdots常用激光和荧光素搭配常用激光和荧光素搭配uBluelFITClPElPerCPlPerCP-Cy5.5lPE-Texas Red(ECD)lPE-Cy5lPE-Cy7lPIlEGFPuRedlAPClAPC-Cy7uUVlDAPIlHoechst常用的标记单克隆抗体的荧光素常用的标记单克隆抗体的荧光素u488nm激光激发：激光激发：lFITC（异硫氰酸荧光素）：（异硫氰酸荧光素）： 荧光强度可受荧光强度可受pH的影响，当的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱降低时其荧光强度也随之减弱lPE（藻红蛋白）（藻红蛋白）lPerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上应用在检测表达较高的抗原上lPerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物）（叶绿素蛋白偶联物）lPE-Cy7（藻红蛋白偶联物）（藻红蛋白偶联物）lPE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome）lPE-Texas Red（藻红蛋白（藻红蛋白- -德州红偶联物，又称德州红偶联物，又称ECDECD）u633nm激光激发：激光激发：lAPC（别藻青蛋白）（别藻青蛋白）lAPC-Cy7（别藻青蛋白偶联物）（别藻青蛋白偶联物）荧光及荧光发生机理简介荧光及荧光发生机理简介u荧光及荧光素：荧光及荧光素：l某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线比照射光波长长的光线 即荧光。受激发后能产生荧即荧光。受激发后能产生荧光的物质称光的物质称荧光物质或荧光素荧光物质或荧光素. .u荧光发生机理：荧光发生机理：l室温下荧光素分子大部分处于室温下荧光素分子大部分处于“基态基态”，当荧光素在一，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为跃迁，进入新的状态，称为“激发态激发态”，处于激发态的，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在分子不稳定，它可以通过在10-910-7秒的极短时间内以秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。荧光素的激发和发射光谱荧光素的激发和发射光谱u任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）u激发光谱（激发光谱（Excitation，Ex）：）：l是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。也称为吸收光谱。l吸收波峰（最大吸收波长）：吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Maxu发射光谱（发射光谱（Emission）：l是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光光l发射波峰（最大发射波长）：发射波峰（最大发射波长）：Em-Maxu荧光素的使用：荧光素的使用：l选择正确的激光器选择正确的激光器l确定所需荧光探测器（确定所需荧光探测器（PMT）区别区别488nm 520nm异硫氰酸荧光素（FITC）光学系统：滤光片光学系统：滤光片置于荧光探测器前，利用二向色性长通滤片置于荧光探测器前，利用二向色性长通滤片( (DL)及带通滤片及带通滤片( (BP) )可将不同荧光染料发出的相应波长光谱区别开可将不同荧光染料发出的相应波长光谱区别开 反射光反射光通过光通过光 光源光源二向色性长通滤片二向色性长通滤片( (DICHROIC FILTER)，一定波长以上的光通过，该波定波长以上的光通过，该波长以下的光被反射。长以下的光被反射。4545度角放置。度角放置。 550nm 的光通过的光通过 550nm 的光被反射的光被反射带通滤片带通滤片( (BAND PASS) )，允许一定波长的光通过。，允许一定波长的光通过。550nm DL 620nm BP（620/20）可以允许可以允许610630nm的光通过的光通过 Fluorescence Spectrum Viewer FITCFluorescence Spectrum Viewer PEFluorescence Spectrum Viewer PE-Cy5Fluorescence Spectrum Viewer PE-Cy7Fluorescence Spectrum Viewer PerCPFluorescence Spectrum Viewer APCFluorescence Spectrum Viewer PIFluorescence Spectrum Viewer EGFPFluorescence Spectrum Viewer DAPIFluorescence Spectrum Viewer FITC和和EGFP能否一起使用能否一起使用荧光染料比较荧光染料比较( (平均荧光强度平均荧光强度) ) Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统试剂系统PerCP APC FITC ECD PC5 PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP APC FITC ECD PC7 PC5 600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如PE-Cy5/ PE-Cy7），可得到较好的S/N比u7. 7. 荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/ / 假阳性结果假阳性结果l一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可以减少干扰。 Thanks !
