分子生物学实验 PCR扩增目的基因.ppt

实验目的实验目的 (1)PCR扩增目的基因红细胞生成因子nap基因 部分片段；(2)掌握PCR扩增原理；(3)学习并熟悉PCR操作实验原理实验原理(1)PCR反应原理模板核酸模板核酸 （ 如：人基因组DNA 0.1ug)扩增引物扩增引物 （一对,各0.25umol/L）TaqDNA聚合酶聚合酶（2.5U）dNTP （四种：各200umol/L)标准的缓冲液标准的缓冲液 10X buffer（KCl、Tris-HCl、 MgCl2、BSA或明胶）无菌双蒸水或三蒸水无菌双蒸水或三蒸水石蜡油或矿物油石蜡油或矿物油 3050ul（封闭、防止高温时液体的 挥发）(2)PCR反应体系总体系一般采用25或50ul 实验步骤实验步骤(1)配制PCR反应体系 25 l 10X PCR Buffer 2.5dNTP 2Primer F 1Primer R 1Template 1Taq 0.5H20 17(2)设置PCR反应条件 95 5min 94 30 sec 55 30sec 72 30sec 72 5min33cycles实验结果实验结果琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果，在反应结果，在500bp左右有明显扩增条带。左右有明显扩增条带。实验目的实验目的 学习利用碱法小量制备质粒实验原理实验原理(一一) 细菌培养物的生长细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗有含有行当抗生素的液体培养基中生长生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒。，然后从中纯化质粒。 (二二) 细菌的收获和裂解细菌的收获和裂解(1)大质粒大质粒(大于大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。释放出来。 (2)可用更剧烈的方法来分离小质粒可用更剧烈的方法来分离小质粒 在加入在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。的超螺旋分子。实验步骤