2022年PCR实用技巧.docx

PCR实 用 技 巧 350784478 金 币 +2 ,VIP+0 >: 感 谢 分 享7-1315:43增 加PCR 地 特 异 性 ：1.primersdesign 这是最重要地一步 .抱负地 , 只同目地序列两侧地单一序列而非其他序列退火地引物要符合下面地 一些条件a. 足够长 ,18-24bp, 以保证特异性 .当然不是说越长越好 , 太长地引物同样会降低特异性 ,并且降低产量b.GC%40%60%d.避 免3' 端GC rich,e.避免3'c. 5' 端 和 中 间 序 列 要 多 GC, 以 增 加 稳 定 性最 后 3 个 BASE 不 要 有 GC, 或 者 最 后 5 个 有 3 个 不 要 是 GC 端 地 互 补 , 否 就 容 易 造 成 DIMERf. 避免3'端地错配g. 避 免 内 部 形 成 二 级 结 构h. 附加序列 RT site, Promoter sequence>加到 5' 端, 在算 Tm 值时不算 ,但在检测互补和二级结构是 要加上它们i. 使用兼并引物时 , 要参考密码子使用表 ,留意生物地偏好性 ,不要在 3'端使用兼并引物 ,并使用 较高地引物浓度1uM-3uM>j. 最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar , VectorNTI,Onlinedesgin etal.* 引物地另一个重要参数是熔解温度<Tm ）.这是当 50 地引物和互补序列表现为双链DNA 分子时地温度.Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需地 .在抱负状态下 ,退火温度足够低 ,以保证引物同目地序列有效退火 , 同时仍要足够高 ,以削减非特异性结合 .合理地退火温度从 55 到 70 .退火温度一般设定比引物地Tm低5. 设 定 Tm有 几 种 公 式 . 有 地 是 来 源 于 高 盐 溶 液 中 地 杂 交 , 适 用 于 小 于 18碱 基 地 引 物 . 有地是依据 GC 含量估算 Tm. 确定引物 Tm 最可信地方法是近邻分析法 .这种方法从序列一级结构和相 邻 碱 基 地 特 性 预 测 引 物 地 杂 交 稳 定 性 . 大 部 分 计 算 机 程 序 使 用 近 邻 分 析 法 . 依据所使用地公式及引物序列地不同,Tm 会差异很大 .由于大部分公式供应一个估算地Tm 值, 全部退火温度只是一个起始点 .可以通过分析几个逐步提高退火温度地反应以提高特异性.开头低于估算地Tm5 , 以 2为增量 ,逐步提高退火温度 .较高地退火温度会削减引物二聚体和非特异性产物地势成. 为获得正确结果 ,两个引物应具有近似地Tm 值. 引物对地 Tm 差异假如超过 5,就会引物在循环中使用较低地退火温度而表现出明显地错误起始.假如两个引物 Tm 不同,将退火温度设定为比最低地Tm 低5 或者为了提高特异性 ,可以在依据较高Tm 设计地退火温度先进行5 个循环,然后在依据较低Tm 设计地退火温度进行剩余地循环 .这使得在较为严紧地条件下可以获得目地模板地部分拷贝.2. stabilityof primers定 制 引 物地 标 准 纯 度 对 于 大 多 数PCR应 用 是 足 够 地 . 引物产量受合成化学地效率及纯化方法地影响.定制引物以干粉形式运输.最好在 TE 重溶引物 , 使其最终浓度为 100M.TE 比去离子水好 ,由于水地 pH 常常偏酸 ,会引起寡核苷地水解 . 引物地稳固性依靠于储存条件 .应将干粉和溶解地引物储存在 -20 .以大于 10M浓度溶于 TE 地引物在 -20 可以稳固储存 6 个月, 但在室温 <15 到 30 ）仅能储存不到 1 周.干粉引物可以在 -20 储存至少 1 年, 在室温<15到30）最多可以保存2个月.3. optimizereactantsconcentrationa. magnesiomions Mg 离子地作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响 Polymerase地活性 ,一般地情形下Mg 地浓度在 0.5-5mM 之间调整 ,同样要记住地是在调整了dNTPs 地浓度后要相应地调整Mg 离子地浓 度 , 对 实 时 定 量PCR, 使 用 3到5mM带 有 荧 光 探 针 地 镁 离 子 溶 液b. 其他地离子NH4+ K+ 都会影响 PCR,增加 K+ 地浓度后 , 会由于中和了核酸骨架上磷酸基团地负电荷而影响退火地温度, 从而降低了 PCR地 严谨性 stringency>,NH4+也有相同地作用 . MBI 公司地 TAQ 酶就供应了两种 BUFFER, 一种是加 Mg 地一种 是 已经混合了 NH4>2SO4地, 当然,过 高地阳离子浓 度KCL>0.2M>时 ,DNA在94度 根 本不会发生变性 ,当然 也 就 无 从 谈 起 PCR 了 .c.polymerase不同公司地酶效有所不同 ,需要 operator自己把握适合地酶地浓度 ,一些高保真没地效率要远远低于Taq polymerase, 所以可能需要地酶地量也要大一些. 另外 , 一般地情形下 , 变性地温度可以使用9092度 ,变 性 地 时 间 也 可 以 缩 短 ,从 而 保 证polymerase地 活 性d.template50ulPCRSYSTEM=humangDNA0.1ug-1ugE.Coli10ng-100ngLamadaDNA0.5ng-5ngPlasmidDNA0.1ng-10ng=4. termperaturea. denaturation常 规 是 94 度 5 分 钟 , GC Rich 地 摸 板 是 95 度 5 分 钟除了 GC Rich 外, 常规地 APPLICATIONS 可以将这部分时间缩短到 1 到 2 分钟, 或者在 CYCLE 1 时赐予 较 长 地 时 间 , 而 取 消 开 始 地 denaturationb. annealing重点到了：一般情形下 , 是从 55 度开头 .依据情形协作以Mg 离子浓度进行调整 . 有条件地可以做gradientpcr. 退火 地时间 在 30-60S,时间 短一些 可以得 到更好 地成效 . 由于 ,polymerase在annealing temp.时也会有一些活性 . 所以在 A.T.地时间过长 , 会极大地增加非特异性扩增地风险,另外, 在 对 于 一 些 困 难 户 ,比 如 从 gDNA里 扩 增 大 片 段 ,仍 可 使 用 twostepPCR.5. touchdownPCR原 理 很 简 单 , 但 地 确 是 一 个 很 有 用 地 方 法 . 举 个 例 子 ,ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles9430s5030s721min20cycles725min6.热启动hot PCR是除了好地引物设计之外,提高start PCR特异性最重要地方法之一. 尽管 TaqPCRDNA 聚合酶地最佳延长温度在 72 , 聚合酶在室温仍旧有活性.因此, 在进行 PCR 反应配制过程中 ,以及在热循环刚开头,保温温度低于退火温度时会产生非特异性地产物.这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增 . 在用于引物设计位置点由于遗传元件地定位而受限时,如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程地遗传元件地构建和操作,热启动PCR尤为有效. 限制 Taq DNA 聚合酶活性地常用方法是在冰上配制PCR反应液 ,并将其置于预热地 PCR仪. 这种方法简 单 便 宜 , 但 并 不 能 完 成 抑 制 酶 地 活 性 , 因 此 并 不 能 完 全 消 除 非 特 异 性 产 物 地 扩 增 . 热启动通过抑制一种基本成分推迟DNA 合成, 直到 PCR仪达到变性温度 .包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶,在反应体系达到90 度时,PAUSE,将温度保持在70 度以上 ,手工加入 polymerase, 但这个方法过于烦琐, 特殊是对高通量应用,并简洁造成污染 .其他地热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分, 入镁离子或酶 , 包裹起来 ,或者将反应成分 ,如模板和缓冲液 ,物理地隔离开 .在热循环时 , 因蜡熔化而把各种成分释放出来 并混合 在一 起.有很多 公司提供这 样地 酶.=ampliwaxPCRGemsPerkinElmer> TaqBeadHotStartPolymerasePromega> MagnesiumwaxbeadsStratagene>.=象手动热启动方法一样 ,蜡防护层法比较烦琐 ,易于污染 , 不适 用 于 于 高 通 量 应 用 . 仍有一种方法是使用 inactive DNA Polymerase. polymerase 被抗体抑制失活 ,当变性温度超过 70 度时 , 抗 体 也 变 性 了 , 这 样 polymerase 又 被 激 活 了 .7. BoosterPCR 我们知道 1ug human genomic DNA大约在 3X10 5 幂个模板分子 ,这样地模板分子数目可以是引物与模板很好地结合 . 当模板地浓度过低 ,比如低于 100 个分子时 , 引物和模板之间就很难发生反应. 引物简洁自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个boosterPCR 我始终找不到合适地词来翻译这个booster .详细是这样地 .开头几个 cycles 保持 primer 地低浓度 ,保证 primer:template地 molar ratio 在 10 7108.以 确 保 开 始 扩 增 地 准 确 性 . 然 后 boostePrimer地 浓 度 到 正 常 地 水 平8. 循环数和长度确定循环数地基本原理是 : 产物能够保证你进一步分析操作地最小循环数.由于过多地循环数简洁造成ERRORS和非特异性产物地积累产物 地量不够,优化地1.增加2.如何确增定循加环数,循有一个环方方 法 有 :TEMPLATE数法.分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul, 一起跑电泳分析. 从而确定地循环数做一个 PCR体系,40 循环,50ul,最佳另一个会影响PCR 特异性地是PCR cycling 时在两个温度间变化地速率 rampingrate>. 当然是越高越 好 . 不 过 咱 们 大 部 分 条 件 有 限 , 就 那 么 几 台 PCR 仪 , 也 没 有 多 少 挑 选 地 余 地9. thermalcycler PCR 仪地因素我们常常简洁忽视 .长时间地使用后需要调整 PCR 仪, 以保证其能够到达正确地温度 .现在 地 PCR 仪 基 本 上 都 有 自 检 功 能 self-diagnosis>.10. PCRadditives 附加物或者说 enhancer 实在是多种多样 . 基本上包括几类 , 能够增加反应退火效率地化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本地原理不外是增加引物退火特异性,削减错配 , 增加产物地长度和产量 . 在 GC Rich 情形中, additive可以造成配对碱基间地地不稳固,从而提高扩增地效率 .而在另一种情形下,additive 由于造成错配地primer-template复合物地极大地不稳固 , 而提高了扩增地忠实性 . 要留意地是,没有万能地enhancer全部通用 , 需要你依据自己地情形 ,最好结合 gradientpcr 挑选最优条件 .=dimethylsulfoxideDMSO>upto10%formamideat5%trimethylammoniumdetergentssuchaschlorideTween2010-100uM0.1-2.5%polyethyleneglycolPEG>60005-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32protein1nME.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM7Taqdeaza-dGTPforGCrich>Extender150uMwith50uMdGTPstratagene>PerfectMatchPCREnhancerstratagene> Q-solutionQiagen>=要留意地是,DMSO,GLYCEROL 等会抑制polymerase地活性 , 所以需要scouting出最适地浓度11. TemplateDNApreparation 提取 DNA 时地试剂会抑制 PCR 反应地顺当进行 .因此需要对 TEMPLATE DNA 进行纯化 .特殊是SDS<0.01%> 地情形下就能剧烈抑制 PCR 地进行 . 可以加入一些 nonionic 试剂,如 Tween, Nonid, Trition 之类地反过来抑制 SDS. 仍有 proteinase K 也要除洁净 , 不然会降解 polymerase.12. Nested PCR简洁点说 设计两对引物 , 一对是长地 , 一对是包含在长引物内地 , 用长引物扩增地产物作为其次次扩增 地 模 板 , 这 样 可 以 增 加 产 物 地 量 . 而 且 可 以 减 少 非 特 异 性 带 和 错 配 地 情 况 .增加PCR地保真性高保真酶高温 DNA POLYMERASE是以单链 DNA 或 RNA 为模板 ,在 dNTP 和一些阳离子地存在情形下 , 在特定地 引 物 指 导 下 按 3'-5' 方 向 合 成 DNA. 包 括 3 种 类 型a.5'-3' 方向地 DNA 合成才能 ,没有 3'-5' 方向地外切酶特性 .如 Taq 及其突变体 .这类酶地合成才能强 ,由于 他 不 纠 正 合 成 中 出 现 地 突 变b. 与 a 类似 ,有合成活性 ,没有 3-5 地外切活性 . 但他们能以 RNA 为模板 ,合成 DNA. 如 Tth DNA Polymerasec.有 DNA 聚合活性 ,没有逆转录活性 ,但有 3-5 方向地外切酶活性 .如 pfu DNA Polymerase. 可以提高忠实 性 . 但 是 这 些 聚 合 酶 地 产 量 比 Taq DNA 聚 合 酶 低 .酶地混合物将 Taq DNA 聚合酶同带有 3' 到 5'外切核酸酶活性其次种聚合酶混合在一起可以获得比单独 Taq DNA 聚 合 酶 高 地 忠 实 性 , 并 可 以 得 到 高 产 量 及 扩 增 长 模 板 .其他因素除了酶, 高浓度地 dNTP 或镁离子会降低忠实性 . 将 dNTP 地浓度从 200M降低到 25- 50M可以增加精确度假如四种核苷地浓度不同 ,忠实性会受影响 .进行较少地 PCR 循环也会有助于增加忠实性 ,由于增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性.1简介寡聚核苷酸引物地挑选,通常是整个扩增反应胜利地关键.所选地引物序列将打算PCR 产物地大小、位置、以及扩增区域地 Tm 值这个和扩增物产量有关地重要物理参数 .好地引物设计可以防止背景和非特异产物地产生 ,甚至在 RNA-PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模板 .引物设计也极大地影响扩增产量：如使用设计粗糙地引物 ,产物将很少甚至没有；而使用正确设计地引物得到地产物量可接近于反应指数期地产量理论值 .当然,即使有了好地引物 ,依旧需要进行反应条件地优化,比如调整Mg2+ 浓度, 使 用特 殊 地共 溶剂 如二 甲 基亚 砜、 甲酰 胺和 甘 油. 运算机帮助引物设计比人工设计或随机选取更有效.一些影响 PCR 反应中引物作用地因素诸如溶解温度、引物间可能地同源性等 ,易于在运算机软件中被编码和限定.运算机地高速度可完成对引物位置、 长度以及适应用户特殊条件地其他有关引物地变换可能性地大量运算.通过对成千种组合地检测 ,调整各项参数 , 可提出适合用户特殊试验地引物.因此通过运算机软件挑选地引物地总体“质量 ”<由用户在程 序参 数 中设 定） 保证 优 于通 过人 工导 出地 引物 . 需要指出地是 ,引物不必与模板完全同源,因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5端地各种修饰 ,这 种 对 引 物 地 修 饰 不 会 妨 碍PCR 反 应 , 而 会 在 以 后 使 用 扩 增 子 时 发 挥 作 用 .2 基本PCR引物设计参数引物设计地目地是在两个目标间取得平稳：扩增特异性和扩增效率.特异性是指发生错误引发地频率. 特异性不好或劣等地引物会产生额外无关和不想要地PCR 扩增子 ,在 EB 染色地琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR 循环中一对引物扩增地产物与理论上成倍增长量地接近程度. 引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度掌握.假如 PCR地退火温度设置在近于引物Tm 值< 引物/ 模板双链体地解链温度）几度地范畴内,18 到 24 个碱基地寡核苷酸链是有很好地序列特异性地.引物越长 , 扩增退火时被引发地模板越少 .为优化 PCR 反应,使用确保溶解温度不低于54 地最短地引物 , 可获得最好地效率和特异性. 总地来说 , 最好在特异性答应地范畴内寻求安全性.每增加一个核苷酸 ,引物特异性提高 4 倍；这样 ,大多数应用地最短引物长度为18 个核苷酸 .引物设计时使合成地寡核苷酸链<18 24 聚物）适用于多种 实验 条 件仍 不失 为明 智 之举 . 引物 地二 级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等. 这些因素会影响引物和模板地结合从而影响引物效率.对于引物地 3末端形成地二聚体 , 应掌握其 G大于 -5.0kcal/mol 或少于三个连续地碱基互补 ,由于此种情形地引物二聚体有进一步形成更稳固结构地可能性 ,引物中间或 5端地要求可适当放宽 .引物自身形成地发卡结构 ,也以 3端或近 3端对引物 - 模板结合影响更大；影响发卡结构地稳固性地因素除了碱基互补配对地键能之外,与茎环结构形式亦有很大地关系.应尽量防止 3末端有发卡结构地引物.引物GC含量和Tm值PCR引物应当保持合理地 GC 含量.含有 50 地 G+C 地 20 个碱基地寡核苷酸链地 Tm 值大致在 56 62范畴内 ,这可为有效退火供应足够热度 . 一对引物地 GC 含量和 Tm 值应当和谐 .和谐性差地引物对地效率和特异性都较差 ,由于降低了 Tm 值导致特异性地丢失 .这种情形下引物 Tm 值越高 , 其错误引发地机率也越大 .如采纳太高地退火温度 ,Tm 值低地引物对可能完全不发挥作用.在从一批在特定序列范畴内已合成好地寡核苷酸中挑选一对新地引物时,这种 GC 含量和 Tm 值地和谐特别关键 .一般来说 ,一对引物地 Tm 值相差尽量不超过 23 摄氏度,同时引物和产物地 Tm 值也不要相差太大 ,20 摄氏度范畴内较好.引物地额外序列与退火温度如有额外地序列信息要加到引物中,例如 T7RNA 聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长地引物 .一般说来 ,引物 5端添加无关序列不会影响引物特异序列地退火.有时候 ,引物中添加了大量与模板不配对地碱基 ,可以在较低退火温度地条件下进行4 到 5 个扩增循环；然后在假定引物 5端 序 列 已 经 加 入 到 模 板 中 , 计 算 得 出 地 退 火 温 度 下 进 行 其 余 地 循 环 . 在引物上添加限制酶位点时一个重要地考虑是大多数限制酶地有效切割要求在它们地识别序列地5 端有 2 至 3 个非特异地额外碱基 ,这样就会增加引物地非模板特异序列地长度.长引物序列地另一个缺 点是影响溶解温度地精确运算 ,而这对于确定 PCR 反应时地退火温度又是必需地 .对于低于 20 个碱基地引物,Tm 值可以依据 Tm=4G+C>+2A+T>运算 .而对于较长地引物 ,Tm 值需要考虑动力学参数、从“最近邻位 ”地运算方式得到 ,现有地 PCR引物设计软件大多数都采纳这种方式.引物地 3末端核苷酸组成引物 3末端和模板地碱基完全配对对于获得好地结果是特别重要地,而引物 3末端最终 5 到 6 个核苷酸地错配应尽可能地少 .假如 3末端地错配过多 , 通过降低反应地退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败. 引物 3末端地另一个问题是防止一对引物内地同源性.应特殊留意引物不能互补 ,特殊是在 3末端 . 引物间地互补将导致不想要地引物双链体地显现, 这样获得地PCR 产物其实是引物自身地扩增 . 这将会在 引 物 双 链 体 产 物 和 天 然 模 板 之 间 产 生 竞 争 PCR 状 态 , 从 而 影 响 扩 增 成 功 . 引物 3末端地稳固性由引物 3末端地碱基组成打算 , 一般考虑末端 5 个碱基地 G.此值地大小对扩增有 较 大 地 影 响 , 负 值 大 , 就 3末 端 稳 定 性 高 , 扩 增 效 率 更 高 , 同 时 也 更 易 于 异 位 引 发 . 需要留意地是 ,引物 3末端应尽量防止 T.试验证明 ,以 T 结尾地引物即使与 T, G 或 C 错配仍可有效延长.PCR产物地长度及在耙序列内地位置全部地运算机程序都供应对 PCR 产物长度范畴地挑选 .一般说来 ,PCR 产物长度对扩增效率有影响 .特定 地 应 用 情 况 下 ,PCR 产 物 长 度 部 分 取 决 于 模 板 材 料 . 预期产物地特定长度常常取决于应用地需要 .如目地是建立测定特异 DNA 片段地临床检验方法 ,120 300bp 地小 DNA 扩增产物可能是最好地 .产物应具有好地特异性和高地产生效率 ,并含有能用于探针捕获杂交试验地足够信息 .这一长度范畴地产物可以通过采纳两步扩增循环方法得到 ,从而削减扩增时间 .其他 PCR方法有不同地正确产物长度 .例如,通过定量地 RNA-PCR检测基因表达时 ,产物应当足够大以便构成竞争性模板 ,这样, 产物和竞争物都能够在凝胶上很简洁地辨论出来. 这些产物一般在250 750bp范围内.补充说明如在 cDNA 序列内找寻 PCR 引物, 需特殊留意两点：第一 ,尽力将引物和产物保持在mRNA 地编码区域内,由于这是生成蛋白质地特殊序列,不像 3末端非编码区域与很多其他mRNA 有同源性；其次 ,尽力把引物放在不同地外显子上 ,以便使 RNA 特异地 PCR产物与从污染 DNA 中产生地产物在大小上相区别. 如 PCR 地目地是克隆一个基因或cDNA 地特异序列 ,产物地大小是依据详细应用预选地.在这里 ,运算机程 序 可 以 提 供 关 于 期望 区 域 侧 翼 选 择 引 物 对 地 信息 . 在挑选用来扩增来自不同物种DNA 地引物时 ,应躲开 mRNA 地 5和 3末端非翻译区序列 ,由于它们可能没有任何地同源性.3 简并引物设计设计简并引物时 ,肯定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码地简并度. 很明显 ,我们期望挑选简并度最低地氨基酸 ,达到提高特异性地目地 .充分留意物种对于密码子地偏好性,挑选该物种使用频率高地密码子 ,以降低引物地简并性 .应努力防止 3末端地简并 ,对于大多数氨基酸残基来说 ,意味着引物 3末端不要位于密码子地第三位. 在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤<dI ）代替简并碱基.4 测序引物设计当然,测序引物地设计一般都由测序公司来完成,假如需要自己设计地话；那么除了依据上面所提到地引物设计通用标准外,仍需要注意两点：测序引物地特异性地标准把握应当更严格一些,也就是说设计时更优先考虑特异性.由于在测序反应中,假如引物与模板在非预期位置退火并引发链延长,会对结果对来很大地干扰甚至造成结果无法识读.测序引物地 Tm 值适当高一些 .现在大部分测序反应均选用耐热地测序级DNA 聚合酶来催化 ,并采用 PCR 地热循环程序 .选用地测序引物地 Tm 值稍高一些 ,有助于使反应顺当跨过待测模板地二级结构区,也有助于降低非特异反应.5 探针地设计探 针 地 设 计 , 根 据 不 同 地 用 途 各 有 其 设 计 特 点 , 这 里 只 是 就 通 用 地 原 就 进 行 讨 论 ：探针地长短一般在20-50核苷酸之间 ,过长合成成本高 ,且易显现聚合酶合成错误 ,杂交时间长 .太短就特异性下降 .留意 G 和 C 地含量努力掌握在 40-60 ,同时一种碱基连续重复不超过4 个, 以免非特异性杂交产生 .探针自身序列不能形成二聚体,也不能有 “发夹 ”结构存在 ,这一点上地要求就要比一般引物设计严格得多 .假如探针地靶目标是多个基因地混合物,就必需掌握该探针与无关基因之间地 相似性在70%以下. PCR中常见问题分析与对策 PCR产物地电泳检测时间一般认为 PCR产物应在 48h 以内完成电泳检测 ,有些最好于当日电泳检测 ,大于 48h 后带型就会显现不 规 就 , 甚 至 消 失 .Troubleshootingguide1 假阴性,不出现扩增条带PCR 反应地关键环节有模板核酸地制备, 引物地质量与特异性 ,酶地质量 , PCR 循环条件 .查找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 模板：模板中含有杂蛋白质,模板中含有 Taq 酶抑制剂 ,模板中蛋白质没有消化除净, 特殊是染色体中地组蛋白 ,在提取制备模板时丢失过多 ,或吸入酚 .模板核酸变性不完全 .在酶和引物质量好时,不显现扩增带 ,极有可能是标本地消化处理 ,模板核酸提取过程出了毛病 ,因而要配制有效而稳固地消 化 处 理 液 , 其 程 序 亦 应 固 定 不 宜 随 意 更 改 . 酶失活：需更换新酶 ,或新旧两种酶同时使用 ,以分析是否由于酶地活性丢失或不够而导致假阴性 .需注 意 地 是 有 时 PCR 时 忘 了 加 Taq 酶 或 电 泳 时 忘 了 加 溴 化 乙 锭 . 引物：引物质量、引物地浓度、两条引物地浓度是否对称 ,是 PCR 失败或扩增条带不抱负、简洁弥散地常见缘由 .有些批号地引物合成质量有问题 ,两条引物一条浓度高 , 一条浓度低 ,造成低效率地不对称扩增, 计策为：选定一个好地引物合成单位 .引物地浓度不仅要看 OD 值,更要留意引物原液做琼 脂糖凝胶电泳 ,肯定要有引物条带显现 ,而且两引物带地亮度应大体一样 ,如一条引物有条带 ,一条引物无条带 ,此时做 PCR 有可能失败 ,应和引物合成单位协商解决 .如一条引物亮度高 ,一条亮度低 ,在稀释引物时要平稳其浓度 .引物使用过程中应高浓度小量分装储存 ,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分 , 导 致 引 物 变 质 降 解 失 效 . 引 物 设 计 不 合 理 , 如 引 物 长 度 不 够 , 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 等 .Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对 PCR扩增效率影响很大 ,浓度过高可降低 PCR 扩增地特异性 ,浓度过低就 影 响PCR扩 增 产 量 甚 至 使PCR扩 增 失 败 而 不 出 扩 增 条 带 . 反应体积地转变：通常进行PCR 扩增采纳地体积为20l、30l、50l或 100l,应用多大体积进行PCR扩增,是依据科研和临床检测不同目地而设定,在做小体积如 20 l后,再做大体积时 ,肯定要重新摸索条件,否就容易失败. 物理缘由：温度对PCR 扩增来说相当重要 .假如变性温度低 ,变性时间短 ,极有可能显现假阴性；退火温度过低 ,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高,影响引物与模板地结合而降低PCR 扩增效率 .有时仍有必要用标准地温度计 ,检测一下 PCR 仪或水浴锅内地变性、退火和延长温度,这也是PCR失败地原因之一. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合 ,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功地.2 假阳性引物设计不合适：挑选地扩增序列与非目地扩增序列有同源性, 因而在进行 PCR 扩增时 ,扩增出地PCR 产 物为 非 目地 性 地序 列 . 靶 序列 太 短或 引物 太 短, 容 易出 现假 阳 性. 需 重新 设计 引物 . 靶序列或扩增产物地交叉污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段地交叉污染, 导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：操作时应当心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管 外. 除了酶及其他不耐高温地物质外,全部试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及进样枪头均应一 次性使用 .必要时 ,在加标本前 , 反应管和试剂用紫外线照耀 ,以破坏存在地核酸 .二是空气中地小片段 核酸污染 ,这些小片段比靶序列短 , 但有肯定地同源性 .可相互拼接 ,与引物互补后 ,可扩增出 PCR 产物, 而导致假 阳性地 产生,可 用巢 式PCR方法 来减轻 或消 除.3 出现非特异性扩增带PCR 扩增后显现地条带与估计地大小不一样, 或大或小 ,或者同时显现特异性扩增带与非特异性扩增带. 非特异性条带地显现,其缘由：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低,及 PCR 循环次数过多有关 .其次,是酶地质和量 ,往往一些来源