2022年分子生物学技术在诊断水产养殖传染病中的应用.docx

精品学习资源分子生物学技术在诊断水产养殖传染病中的应用我国是水产养殖大国，水产养殖业在国民经济中占有重要位置；近二十年来，由于生态环境的恶 化，我国水产养殖业，特殊是贝类及虾类养殖业受到传染病严峻影响；这种传染病最初往往以流行病显现，随后进展成为地方流行病，最终造成毁灭性的后果；因此，如何快速精确预报和诊断水产动 物 的 疾 病 ， 成 为 水 产 养 殖 发 展 计 划 或 经 营 部 门 十 分 重 要 而 突 出 的 问 题 ；为了达到预报目的，必需建立一种可快速诊断全部各种病原体的技术方法，使之既适用于试验室的条件，也可为水产养殖现场所采纳；过去，主要采纳光学显微镜组织化学流行病学的调查方 法；由于其制作过程纷杂，标本观看耗时，因而难于广泛应用；另外，光学显微镜术不能定量地确定动物感染程度，对病毒的感染也无法诊断；近年来，由于现代生物技术和分子生物学的快速发 展，已经有可能为贝、虾类病原体检测和诊断供应一种快速有效而且特异性和灵敏度高的技术手 段；本文介绍在免疫学方面及以核酸杂交为基础的技术方法及原理，并分析它们应用于贝、虾类等水产养殖方面的优缺点；一、免疫学方法兔疫学方法是利用特异性抗原抗体反应；观看和讨论组织细胞特定抗原或抗体 的定位和定量技术；为了显示和观看这种抗原抗体反应，需要预先将某种标记物结合到抗体上，借标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜进行定性、定位或定量讨论；在水产养殖方面 ， 可 用 这 种 技 术 作 为检 测 贝 类 和虾 类 病 原 体 手 段 ；1、免疫试剂由于无脊椎动物缺乏免疫球蛋白介导的免疫应答，要对感染进行免疫诊断，只能依据抗体对病原体的特异反应；因此，抗体是任何免疫检测手段最重要的组分；所选用的标准抗体试剂必需具有一 定 的 特 异 性 和 灵 敏 度 ， 才 能 对 检 测 结 果 进 行 正 确 的 分 析 和 解 释 ；(1) 多克隆抗体polyclonalantibodies多克隆抗体就是传统的抗体制备的一抗血清，即以特定抗原兔疫动物后取其血清作为抗体；长期以来，多克隆抗体由于制备简洁，可与高纯度的抗原进行免疫反应，已经广泛用于细菌检测；贝类和虾类多数的病原体是胞内原生动物、立克次氏体（rickettsia ）及病毒；由于海洋无脊椎动物仍没有建立细胞系，这些病原体不能在体外产生；制备免疫所需要的抗原，只能依靠分别和纯化这些胞 内 病 原 体 ； 现 在 ， 已 经 有 几 种 有 效 制 备 高 特 异 性 抗 体 的 纯 化 手 段 ；多克隆抗体由于含有多种抗体成分，因而会产生个体免疫应答；在一批血清之间，常常可观看到一些重要的变异性；此外，多克隆抗血清产生普遍性的免疫应答，它们含有一个可与很多不同免疫原打算簇，特殊与污染的宿主抗原起反应的抗体群；产生这种非期望的交叉反应会造成假阳性诊断，因而阻碍免疫检测的实际应用；实践中利用以下几种方法，提高多克隆抗血清的特异性； 稀 释 高 滴 定 度 抗 血 清 ， 以 消 除 低 水 平 的 交 叉 反 应 ， 保 留 特 异 反 应 ； 用 宿 主 抗 原 吸 收 抗 血 清 ， 以 除 去 交 叉 反 应 的 抗 体 ；以上措施可供应合适的特异性；多克隆抗血清特殊适合于检测那些变异的潜在变异的病原体，其不同抗原打算簇可被异质性的抗体识别；对于间接免疫荧光检测，多克隆抗体是种很好的免疫试剂 ， 但 对 于 酶 联 兔 疫 吸 附 检 测 enzymed-linkedimmunosorbentassay 就 不 合 适 ；(2) 单克隆抗体在 需 要 大 量 特 异 性 相 似 的 免 疫 试 剂 的 情 况 下 ， 单 克 隆 抗 体 是 很 有 用 的 ；Kohler 和 M lStein1975 ， 1976制造了产生单克隆抗体小鼠杂交瘤hybridoma 的方法，为制造和欢迎下载精品学习资源使用抗体开创了一个新纪元；杂交细胞系的无隆化挑选和长期生长，保证了其抗体产物的单克隆性、高特异性和永久产生的特性；其基本原理是:脾脏的 B 淋巴细胞能产生特定的抗体，它是一种终末分化的浆细胞，在体外培育中很难存在，而骨髓瘤myeloma 细胞在体外可以连续传代培育，长期存活；因此，将此两细胞融合，可获得具有瘤细胞无限繁衍的特点和B 淋巴细胞产生针对某抗原打算簇的抗体功能的杂交瘤hybridoma 细胞系，杂交瘤经挑选，将B 淋巴细胞杂交瘤单个分别，长成分泌特异性抗体的细胞克隆；杂交瘤可以冷冻或贮存在液氮或一70；C 之中，然后复苏，保证不断产生单一的抗体；单克隆抗体这些潜在的优点，使它们作为免疫试剂在海洋无脊椎动物病理学诊断中应用，具有很大的吸引力；早先诊断平牡蛎 Ostrea edulis 中一种血细胞内寄生原生动物 Bonamia ostreae，就是应用单克隆抗体技术胜利例子；另外，这种技术也应用于诊断港湾扇贝 Pecten maximus 的鳃立克次氏体，与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒 Lymphocystivitius 及菲律宾蛤仔（ Tapes philippinatum ） 棕 环 病 病 因 弧 菌 P1VibrioP1；2、 免 疫学 检测(1) 间接免疫荧光检测IIFA免疫荧光法是预先将荧光素标记在抗体上，再与涂片、切片上或细胞悬液中的抗原进行反应， 借助荧光显微镜观看是否有荧光素的荧光，判定是否存在相应的抗原并确定其相应的位置；间接免疫荧光法就是先用与检测标本中抗原相应的特异抗体第一抗体， 1 抗进行反应，完全洗去余外1 抗后，再用荧光素标记抗1 球蛋白的抗体 其次抗体， n 抗与之作用；此法灵敏性很高，但由于参与反应的因子和层次较多，易受干扰，产生非特异性反应，故需多种对比才能精确判定结果；一旦得到特异的多克隆或单克隆抗体，就可用间接免疫荧光进行检测；把受感染的组织涂布在显微镜用的载玻片上，用丙酮固定，增加细胞膜透性，促进抗体与病原体的抗原结合；UIFA 适合于很多类型病原性，而且极为灵敏；它可用于直接观看，甚至可鉴别单个感染的细胞；UIFA 可以用任何一种表面荧光显微镜检测；这种仪器是试验室及水产养殖场较为普遍的设备；由于免疫球蛋白与某些无脊椎动物血细胞类细胞具有潜在的非特异性反应，因此在使用 IIFA 方法时必需制备使用 且 抗 标 记 抗 体 处 理 的 对 照 标 本 ， 这 是 一 种 非 常 重 要 的 预 防 措 施 ；(2) 酶联免疫吸附测定ELISAELISA是利用酶与底物反应来检测抗原或抗体的方法；酶通常偶联于抗体；使酶活性及偶联物的免疫反应都能保持住是检测的关键；酶偶联物的数量由相应底物的转换量来确定；一般挑选那些 与底物反应能产生易于检测的颜色或发出荧光的酶；碱性磷酸酶和对硝基苯磷酸盐是一对有用的酶和 底 物 ， 它 们 的 反 应 物 是 深 黄 色 ， 易 于 检 测 的 对 硝 基 苯 酚 ；这种方法快速简洁，灵敏度高，可定量，因而广泛用于人及动物的病原体免疫检测；在实践中，为了检测象器官匀浆复杂的生物混合物样品中的抗原，采纳这种三夹层式的ELISA特殊适用；结合到固相的末标记抗体与标本中待测的抗原特异结合，无关的物质可在洗涤中除去；随着标记特异抗体相继固定在捕捉到的病原体上，底物溶液变为有色产物，就显示为阳性反应；颜色的强度用分光光度法确定，其强度与相结合的连接物的量成正比，因而也就与存在于标本中的抗原的量成正比 ； 一 般 ， ELISA是 在 96孔 的 培 养 板 进 行 ， 所 有 的 步 骤 都 可 自 动 进 行 ；用贝类和虾类病原体所做的试验说明，单克隆抗体的亲和性并不会由于与固相结合或用酶标记而受到破坏；用多克隆抗体主要限制在于需要高浓度和大量的抗体掩盖固相物，因而以多克隆抗体为基础的ELISA主要用于提纯病原体的研究；二、以核酸杂交为基础的方法欢迎下载精品学习资源1、核酸探针(1) DNA克隆探针贝类和虾类病原体遗传方面的资料很少，要制备某种病原体的探针，只能用该种特有的序列组成的克隆基因组 DNA 片段；因此纯化病原体是 DNA 克隆的基本条件；目前提取、消化和 DNA 克隆技术都是很成熟的方法，只要具备分子生物学基本学问就可以学会和把握这些技术；在有B. ostreae，Marteilia refringens 或立克次氏体所作试验中，只要从几个受感染的动物所获得的一次纯化的病原体，就可得到足够量的 DNA ，并形成成千上万的重组克隆，随后利用凝胶电泳确定插入片段的大小，每个重组克隆然后建成一个无限单一探针供应源；探针的特异性和灵敏性一方面取决于大小和序列，另方面也取决于标记方法；对探针的标记可利用商品化的试剂盒进行；不过，在水产养殖中一般喜爱采纳非放射性标记；这种标记方法不会对探针与靶标的杂交产生重大影响；(2) 合成探针近年来，寡核核酸合成进展很快；一旦得到病原体的序列，就可以在试验室合成特异性非常精确的探针，而且可对寡核核酸进行直接标记；当前由于多数试验室可以利用运算机把DNA 序列与有关资料信息数据库联网，因而核育酸合成的重要性与日俱增，其应用前景更为宽阔现在，愈来愈多的病毒和备种病原体的序列已被测定，因而有可能从这些序列中，挑选出共同的保守序列，然后合成某种厂谱特异探针，供实际检测之用，而不受是否得到病原体的限制；这种方法目前已在贝类和虾类中对细小核糖核酸病毒 Picornavirus ，细小病毒 Parnovirus 和 Baculovirus 中进行检测，由于这 些 病 毒 的 已 知 序 列 在 从 昆 虫 病 毒 到 脊 惟 动 物 病 毒 中 郡 表 现 出 共 同 相 似 性 ；2、以核酸为基础的检测(1) 点印迹法dot-blotassay点印迹法是一种特殊适用于流行病学检测的核酸杂交技术；它是直接将样品点样在硝酸纤维素纸 n；trocelluloSepaper ，简称 NC 上使之成斑点；然后用序列专一的、经放射性标记的单链核酸即探针 与每一斑点杂交，将末杂交的探针洗掉；通过杂交斑点的放射自显影，估测与样品核酸杂交的探针的量，依据放射性映象的强度确定每一斑点的探针浓度，并同一系列对比作比较以确定特定核酸的浓度；2聚合酶链反应Polymerasechainreaction,PCR聚合酶链反应是一种挑选性体外扩增DNA 或RNA 片段的方法；它实际上是在模板DNA 引物和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应；PCR 技术的特异性取决于 引 物 primer和 模 板 templateDNA结 合 的 特 异 性 ； 反 应 分 三 步 进 行 ： 变性 denaturation: 通 过加 热使 DNA双 螺旋 的氢 键断 裂， 双链 解离 形成 单链 DNA ；退火 anneallng: 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物复杂，而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 之间互补的机会较少；延长 extension: 在 DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+ 存在的条件下， 5'一3'的聚 合 酶 催 化以 引 物 为起 始 点 的DNA链 延 伸 反 应 ；以上 3 步为一循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间 的 特 异 性DNA片 段 得 到 了 大 量 复 制 ， 数 量 可 达2×106拷 贝 ；PCR 方法曾应用于贝类与虾类中细小核糖核酸病毒Picornavirus 基因组单链 RNA 的扩增，不过在起动互补链合成，需要使用逆转录酶；在水产养殖申，全部的引物一般采纳病原体DNA克隆片段建立起来的序列，或者是从几种有关病原体之间共同的高度保守序列，也可以从数据库挑选合适欢迎下载精品学习资源的序列进行合成；扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis 或使用内部探针的点印 迹法进行检测； Innis 等1990 曾著文特地介绍PCR 方法在感染病理学诊断的应用；PCR 在检测nMA 靶分子的灵敏度是其他方法难以比拟的，而且标本处理非常简洁；在检测节肢动物中的原核生物时，只要煮沸10 分钟；这种方法也很适合于试验室对海洋无脊惟动物中，由于人为或自然而受立克次氏体及病毒感染的组织和幼体的检测；特殊在对养殖对象进行大规模转移之前进行PCR 检测 ， 判 断 动 物 是 否 有 病 原 体 感 染 ， 是 一 种 既 安 全 又 可 靠 的 办 法 ；3原位杂交insituhybridization原位杂交是用放射性或非放射性标记的已知序列 DNA 或 RNA 探针，在细胞或染色体上，与其互补的核酸序列配对杂交，再经放射自显影或免疫荧光、化学发光在杂交原位上显示杂交体的技术；原位杂交技术包括四大步骤 :细胞或染色体样品制备、探针的制备与标记、原位杂交反应和杂交结果的显示与分析；目前，原位杂交已成为简捷、快速检测细胞感染，特殊病毒感染的手段，甚至可以检测标本中每个细胞有几个靶分子；原位杂交通常采纳良好固定下具有清楚组织学微小结构的材料；水产养殖中最令人感爱好的是利用细胞涂片所进行的原位杂交，以防止石蜡切片中所遇到的复杂步骤和程序；综上所述，贝类和虾类病原体的分子诊断目前已经起步；这些实践说明，水产养殖病理学可以应用在人和兽医医学上所采纳的分子生物学新方法；在应用这些方法上，主要的困难在于病原体的提纯；贝类和虾类感染病原体的诊断的将来主要依靠于讨论和临床应用过程科技工作者以及诊断技术的使用者之间的有效合作；可以预料在我国水产养殖中，随着科技投入的增加，分子生物学的诊断手段将得到愈来愈广泛的应用；欢迎下载