2022年功能基因的克隆及生物信息学研究.docx

精品学习资源功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要： 随着多种生物全基因组序列的获得，基因组讨论正从结构基因组学<structuralgenomics）转向功能基因组学 functional genomics>的整体讨论；功能基因组学利用结构基因组学讨论获得的大量数据与信息评判基因功能 包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等>，其主要手段结合了高通量的大规模的试验方法、统计和运算机分析技术1，它代表了基因分析的新阶段，已成为 21世纪国际生命科学讨论的前沿；功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，进展和应用新的试验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学讨论从对单一基因或蛋白的讨论转向多个基因或蛋白同时进行系统的讨论，是在基因组静态的组 成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学讨论2；如何讨论功能基因， 也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在讨论功能基因方 面的应用做一个简要的阐述；关键词： 功能基因、克隆、生物信息学分析 ；1. 功能基因的克隆1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是依据目标基因在染色体上准确位置，查找与 其紧密连锁的分子标记，选择 BCA克隆，通过染色体步移法逐步靠近目的基因区域，依据测序结果或用 BAC、YAC克隆选择 cDNA表达文库查找候选基因， 得到候选基因后再确定目标基因；优点是无需把握基因产物的任何信息，从突 变体开头，逐步找到基因，最终证明该基因就是造成突变的缘由；通过图位克 隆很多掌握质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些掌握数量性状的主效基因<掌握蕃茄果实大小的基因克隆 3、掌握水稻成熟后稻谷脱落基因克隆 4以及小麦 VRN2 基因克隆 5 等）也通过图位克隆法获得；欢迎下载精品学习资源1.2 同源序列克隆目的基因第一依据已知的基因序列设计 PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待讨论材料的 cDNA 文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步选择基因组文库，选择阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以选择到该基因的完整序列；1.3 结合连锁和连锁不平稳的分析方法结合连锁和连锁不平稳的分析方法是未知基因克隆讨论领域进展的新方向6；Linkagedisequilibrium,LD> ；与连锁分析不同 ,连锁不平稳分析可以利用自然群体中历史发生的重组大事；历史上发生的重组使连锁的标记慢慢分布到不同的同源染色体上 ,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉 ,从而形成大小不同的单倍型片段 Haplotype block>；这样经过很多世代的重组 , 只有相隔很近的基因 ,才能仍处在相同的原始单倍型片段上 , 基因间的连锁不平稳才能依旧存在；所以基于连锁不平稳分析 ,可以实现目的基因的精细定位；林木大多为自由授粉的异交物种 ,所以连锁不平稳程度很低 , 林木基因组中的 LD 可能会仅局限于特别小的区域 , 这就为目的基因的精细定位供应了可能 ,结合 SNP 检测技术 , 科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来 ,进行数量性状寡核苷酸 Quantitativetraitnucleotide,QTN> 作图；当然除了相隔很近的基因 ,某些相隔较远的基因 , 由于受相同的选择压力 ,也可能产生连锁不平稳；但通过家系分析 , 第一可以进行目的基因的粗略定位 , 将目的基因第一限定到一个较小的区域 , 只针对该区域内的SNP进行相关性分析 , 从而排除非由连锁引起的连锁不平稳干扰；随着林木全基因组测序的进展 ,连锁图谱与LD分析相结合的方法将是在林木中实现未知基因克隆的最有效的方法 6；欢迎下载精品学习资源1.4 电子克隆近年来又兴起一种新的基因克隆方法 -电子克隆，它是近年来相伴着基因组方案和EST方案进展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益进展的生物信息学技术，借助电子运算机的庞大运算才能，通过 EST或基因组的序列组装和拼接 ,利用RT-PCR的方法快速获得功能基因 ,具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点7 ；1.4.1 利用 EST数据库信息第一选择感爱好的水稻,EST作为查询探针，搜寻水稻 dbEST数据库，找到部分重叠的 EST进行拼接，然后再以拼接好的 EST重叠群为新的查询探针，连续搜寻dbEST库,直到没有新的 EST可供拼接为止，最终依据拼接好的完整序列设计PC R引物，通过 RT-PCR的方法获得目的 cDNA 克隆并进行序列测定验证 7 ；图1为利用EST数据库信息克隆水稻功能基因的试验流程；欢迎下载精品学习资源图1 利用水稻 EST数据库进行电子克隆的策略1.4.2 利用基因组信息利用基因组信息资料进行电子克隆的最大优点就是基因的克隆不受作物发 育时期或特别环境条件的限制 :可以用来源于任何时期或组织的水稻和其他物种的EST或全长 cDNA序列作为信息探针搜寻位于GenBank或者我国华大公布的水稻基因组序列 :随后依据内含子的规章通过人工拼接或相应的运算机软件猜测:可以得到该基因完整的开放读码框 ,依据拼接的序列结果设计 PCR引物:进一步实行 RT-PCR的方法获得目的基因的 cDNA克隆并进行序列测定 7；详细试验流程见图 2欢迎下载精品学习资源2 生物信息学分析生物信息学 bioinformatics>是在生命科学、运算机科学和数学的基础上逐步进展而形成的一门新兴交叉学科，是为懂得各种数据的生物学意义，运用数学与运算机科学手段进行生物信息的收集、加工、储备、传播、分析与解读的科学 8-10；由于历史缘由，有的讨论者也使用运算生物学computationalbiology> 或运算分子生物学 computationalmolecularbiology>等不同的术语；在后基因组时代，生物信息学的讨论内容主要可分为两个重要 组成部分：基因组信息学和蛋白质组信息学11；后基因组时代，除了连续序列和结构分析外，更多的讨论力气就投入到功能分析，也就是分析讨论遗传型到 表型的过程 12；2.1 基因序列同源性比对及其应用欢迎下载精品学习资源基因序列同源性的比对，对于分析基因组DNA 序列以及完成新基因的染色体定位也是极为便利的；将确定的新基因的编码基因序列作为参照，对于GenB ank数据库中高通量基因序列 htgs>数据库中基因组 DNA 序列进行同源性对比， 当发觉与新基因的 cDNA 序列完全同源的基因组 DNA 序列时，依据 Chambon原就，内含子 intron>的序列总是以 GT开头，以 AG终止，就可以确定该基因的基 因组DNA 序列的结构，及外显子 exon>-内含子序列结构；由于在 htgs数据库收录的基因组 DNA 序列，其染色体的来源是特别清晰的，因此就很简单、很便利地将该基因组进行染色体的定位，而不 再需要进行荧光原位杂交 FISH>的常规的基因染色体定位技术；可见基因的生物信息学技术的进展对于基因组 DNA 序列的确定和在染色体上的定位是多么重要；迟光红等在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA 序列；用 NCBI Blastx分析，得出它具有植物柠檬酸合酶基因的特点结构域，并与其他植物中柠檬酸合酶基因的同源性较高，进一步证明白该cDNA 编码香蕉中的柠檬酸合酶 13；李学农等通过 Internet查询美国国家生物信息中心数据库，数据库采纳 BLAST ，依据Genecard和Ense- mbl获得将 MGC39325基因定位于人染色体 8q1214；2.2 结构分析与功能猜测结构分析的讨论重点在于讨论蛋白质的空间结构；利用分子模拟技术结合运算机图形技术可以更形象、更直观地讨论蛋白质等生物大分子的结构，蛋白质的空间结构的更清晰的表述和讨论对揭示蛋白质的结构和功能的关系、总结蛋白质结构的规律、猜测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等，都是有力的帮忙和促进；同时，也可以对已经被测定的生物大分子的三维结构进行显示和编辑操作；分子模型的建立为下一步进行的分子模拟以及明白结构与功能的关系打下了基础；蛋白质结构猜测是利用已知的一级，二级序列来构建蛋白质的立体结构模型，对蛋白质进行结构猜测需要详细问题详细分析，在不同的已知条件下对于不同的蛋白质实行不同的策略；杨波等以LRP16基因转录产物为目标序列，在人类基因组数据库中搜寻开放阅读框<ORF），利欢迎下载精品学习资源用运算机帮助系统猜测 LRP16蛋白的一级结构、二级结构和三级结构；利用结构域搜寻 LRP16 编码蛋白的同源或相像结构蛋白 15 ；2.3 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析将推导出的蛋白质序列登录到 NCBI 网站 http：/www ncbi nlmn ih gov/>上，用BLAST程序进行序列的同源性检索 16- 18；王安娜等；结果发觉大豆的 C4H蛋白质与绿豆、马铃薯、棉、辣椒、橄榄、烟草、律草属啤酒花等的C4H蛋白质有着很显著的同源性；在BLAST p分析的基础上，选择与其同源性较高的几条序列做聚类分析，对C4H蛋白和其他 C4H蛋白的同源性做进一步分析；在DNAMAN6.0的Treeview显示的结果；结果说明大豆 C4 H和绿豆的 C4H 亲缘关系最近，同源性达95，来自于同一个分枝；其次是紫苜蓿、红车轴草、鹰嘴豆、豌豆,来自同 个次分枝 19；参考文献1 黎裕、王天宇、贾继增 .植物功能基因组学的进呈现状与进展趋势.生物技术通报 2000；6-102 刘斌.生命科技的前沿领域， HIGHTECHNOLOGYANDINDUSTRIALIZATIONAUGUST 2006； 48-543 Frary A, Nesbitt T.C, Frary A, Grandillo S, van der Knaap E, Cong B, Liu J, Meller J, Elber R, Alpert KB, TanksleySD. 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Science, 2004, 3035664>: 16401644.6 尹佟明 HEREDITAS Beijing> 2021 年7月, 327>: 677846.7 黄骥张红生 曹雅君 钱晓茵 杨金水水稻功能基因的电子克隆策略 .中国水稻科学 ,2002,164>；295-298.8 Baldi P, Brunak SBioinformatics ：TheMachineLearningApp roachM Cambridge， Mass： MIT Press，20019 9欧阳曙光 ,贺福初生物信息学：生物试验数据和运算技术结合的新领域J 科学通报， 1999，44 14 >：1457 146810 10陈润生当前生物信息学的重要讨论任务J生物工程进展， 1999，19 4> ： 111411 王正华王勇献后基因组时代生物信息学的新进展国防科技高校学报： 10012486 2003>； 01-06.12 陈铭, 后基因组时代的生物信息学 , 生物信息学 ,1672-55652004>-02-06.13 迟光红,周雪丽,李美英,徐碧玉 ,金志强香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析 .热带农业科学 , 2021,12-18.14 李学农，李亚玲，刘国炳，丁彦青 肿瘤相关未知功能基因 MGC 39325的克隆及生物信息学分析 World Chin J Digestol > ： 1059 1064 2005> 1059-1064.15 杨波,卢学春 迟小华 韩为东 于力 楼方定基于生物信息学分析人类LRP16 基因功能初步讨论癌症2021,28 1>12831290欢迎下载精品学习资源16 16李玉花，刘靖华，徐启江，等现代分子生物学模块试验指南 M北京：高等训练出版社， 2006：295 311.17 孙啸，陆祖宏生物信息学基础 M 北京：清华高校出版社， 2005.18 钟扬，王莉，张亮生物信息学 M北京：高等训练出版社，2003 19 王安娜，王婵婵，吴蕾，李业成，刘成，马凤鸣大豆C4H基因克隆及生物信息学分析东北农业高校学报 2021.41 4>： 12 15.欢迎下载