2022年枯草芽孢杆菌培养基的优化分析研究.docx

精品学习资源目录枯草芽孢杆菌培育基的优化争论- 2 - 1 枯草芽孢杆菌简介及应用 - 3 -1.1 枯草芽孢杆菌简介 - 3 -1.2 枯草芽孢杆菌应用 - 3 - 2 材料和方法 - 4 -2.1 试验材料 - 4 -2.1.1菌株- 4 -2.1.2 培育基- 5 -2.1.3 仪器与设备 - 5 -2.2 培育基的优化 - 5 -2.2.1 培育方法 - 5 -2.2.2 检测方法 - 5 -2.2.3 含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 6 -2.2.4 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.5 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.6 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.7 碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 6 -2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 7 - 3 结果和分析 - 7 -3.1 含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 7 -3.2 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3.3 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.4 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.5 碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 9 -3.6 pH 对枯草芽孢杆菌生长的影响 - 9 -参考文献 - 10 -枯草芽孢杆菌培育基的优化争论摘 要； 随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到重视；而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对欢迎下载精品学习资源枯草芽孢杆菌的争论也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大；为了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培育基进行争论；12本文先就培育基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比， pH 等几个因素作单因素试验；争论说明正确培育基是：稻草 49.05%，玉 M 粉 2.25%，尿素 0.9%， CaCO 1.8% ，KH PO 1.0% ，水含量 57%， pH 7.8；3关键词； 枯草芽孢杆菌 ；培育基优化 ； 应用Bacillus subtilis culture medium optimizationAbstract :along with the country the support to agriculture, microbial fertilizer has application in agriculture has been paid more and more attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a wide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studied more and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order to Bacillus subtilis in industrial production, reduce production cost and can improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentation medium of.This article first medium main raw material, water content, carbon source, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several other factors single factor experiment. Research shows that the optimum medium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO31.8%, KH 3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.81 2.Key words:Bacillus subtilis； medium optimization； application1 枯草芽孢杆菌简介及应用1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌 <Bacillaceae）编号为 Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种；单个细胞 0.7 0.8 ×2 3微M，着色匀称；无荚膜，周生鞭毛，能运动；革兰氏阳性菌，芽孢0.6 0.9 ×1.0 1.5 微M，椭圆到柱状，位于菌体中心或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；菌落表面粗糙不透亮，污白色或微黄色，在液欢迎下载精品学习资源体培育基中生长时，常形成皱醭，需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解12色氨酸形成吲哚；早在 1835 年， Ehrenberg所描述的“ Vibrio subtilis”即是现在大家熟识的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科 Bacillaceae>的模式菌株 ，芽孢杆菌是人类发觉最早的细菌之一；1.2 枯草芽孢杆菌应用 4枯草杆菌 B acillus Subtilis > 是一种重要的 - 淀粉酶生产菌；同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域；随着经济的进展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为亲密，它也必将作为一种特别重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐；5 枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分；枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %；由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着特别重要的作用；欢迎下载精品学习资源 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用5-7欢迎下载精品学习资源枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌 QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局 EPA> 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害；我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用争论也达到了世界先进水平，现已胜利开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品；欢迎下载精品学习资源 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学争论的良好试验材料5欢迎下载精品学习资源枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上仍是对基因组及物理图谱的争论上都处于中心位置，对它的争论涉及各个方面；欢迎下载精品学习资源 枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用5欢迎下载精品学习资源枯草芽孢杆菌是我国答应使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，常常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病；枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能快速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合欢迎下载精品学习资源物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用；另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁衍，维护肠道生态平稳；欢迎下载精品学习资源 枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用5欢迎下载精品学习资源争论证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染；5 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类-和抗生素，使池底积存的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体 氨、硫化氢等 > ，使之先分解为小分子 多肽、高级脂肪酸等 > ，后分解为更小分子的有机物，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中氨基氮 NH3 N> 、亚硝基氮 NO2-N> 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质， 同时仍能为以单细胞藻类为主的浮游植物供应养分物质，促进繁衍；浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解供应氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而削减甚至毁灭水产养殖动物的病原体；越来越多争论发觉，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用；2 材料和方法 6 192.1 试验材料2.1.1 菌株枯草芽孢杆菌2.1.2 培育基牛肉膏蛋白胨液体培育基：5g 牛肉膏， 10g 蛋白胨， 5gNaCl ， 1000mL 蒸馏水， pH 7.27.5 ；牛肉膏蛋白胨固体培育基：5g 牛肉膏， 10g 蛋白胨， 5g NaCl ， 20g 琼脂,1000mL 蒸馏水，pH 7.2 7.5 ；欢迎下载精品学习资源1 号 培 养 基 ：3g 木 屑 ,0.4g 葡 萄 糖 , 0.2g 蛋 白 胨 ,0.2g 酵母 膏 ,0.2g CaCO3,0.1g KH 2PO4 ,16mL 水；2 号培育基： 3g 稻草, 0.4g 葡萄糖 , 0.2g 蛋白胨 , 0.2g 酵母膏 , 0.2g CaCO 3 ,0.1g KH 2 PO4 ,16mL水；3 号培育基：3g 玉 M芯, 0.4g 葡萄糖 , 0.2g 蛋白胨 , 0.2g 酵母膏 , 0.2g CaCO3,0.1g KH 2PO4 ,16mL 水；4 号培育基： 3g 糠壳, 0.4g 葡萄糖 , 0.2g 蛋白胨 , 0.2g 酵母膏 , 0.2gCaCO 3 ,0.1g KH 2PO4 ,16mL水；2.1.3 仪器与设备高压灭菌锅、超净工作台、37摇床培育箱、培育箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、冰箱、三角瓶、接种环、试管、培育皿、酒精灯2.2 培育基的优化2.2.1 培育方法先用接种环接种1 环试管菌种到牛肉膏蛋白胨液体培育基中，200r/min ， 37培育24h，进行扩大培育和活化，然后再取1mL 液体种接种到发酵培育基中，37培育 48h；2.2.2 检测方法活菌的检测方法：称量大致5g 发酵 48h 后的培育基溶解在50mL 无菌水中 ,200r/min ， 20min 摇散得 10，再用 5mL 无菌吸管吸取 5mL 到 45mL 无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL 稀释液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培育基中并涂匀，37培育24h，然后数培育皿上的菌落数7 ；芽孢率的检测方法：称量大致5g 发酵 48h 后的培育基溶解在50mL 无菌水中 ,200r/min ，20min 摇散得 10 ，再用 5mL 无菌吸管吸取 5mL 到 45mL 无菌水中，摇匀得 10 ，依次这样稀释到 10 ，取 0.02mL 滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色 1min ，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清楚的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率；欢迎下载精品学习资源2.2.3 含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响麦麸与稻草的比例确定以后，即可得其含水量为67% ，分别以 75%， 71%， 63% ， 59%，55%代替其含水量作为发酵培育基，在其它成分和条件不变的情形下培育48h，检测各处理后的活菌数和芽孢率，运算得其单位质量的干重的发酵培育基的芽孢数，以确定正确的含水量；2.2.4 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响分别以稻草粗细程度为<0.5mm,0.5 1.0mm,1.0 1.5mm,>1.5mm, 混合样作为发酵培育基，其它组分不变，相同发酵条件下培育48h,检测各的活菌数和芽孢率，以确定稻草的正确粗细程度；2.2.5 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响）SO在相等的 N 含量的条件下，分别用蛋白胨，酵母膏，豆饼粉，尿素，<NH及不同组合作为 N 源，其它成分不变，相同条件下培育48h,检测活菌数和芽孢率，以确定正确N 源；2.2.6 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响确定 N 源后，在保持 C 含量不变的情形下，分别用葡萄糖，蔗糖，玉M 粉，玉 M 淀粉，大M 粉作为 C 源制作发酵培育基，其它组分不变，相同条件下培育48h，测定活菌数和芽孢率，确 定正确 C 源；2.2.7 碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响确定好碳源和氮源之后，转变碳源和氮源的比例，分别采纳0:1,1:3， 1:2， 1:1， 2:1， 3:1， 4:1， 5:1，7:1,1:0 的C/N 比 原料质量比 >配制发酵培育基，其它成分不变，在相同的条件下培育48h，检测发酵料中和活菌数和芽孢率，以确定正确的C/N 比；2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响转变发酵培育基中的pH 值，分别以 pH 值为 5.5， 6.0， 6.5， 7.0，7.5， 8.0， 8.5 作为发酵培欢迎下载精品学习资源养基，其它成分不变，在相同的发酵条件下培育48h，检测活菌数和芽孢率，得正确pH ；3 结果和分析3.1 含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响表 1 含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响含水量活菌数 <10）芽孢率 <%）单位质量培育基的活菌数 <10）75%4.547.21.871%3.465.51.267%1091.13.063%7.667.62.159%1690.93.955%1249.22.7通过对比观看，含水量对枯草芽孢杆菌的芽孢率影响比较大，而对单位质量发酵后的培育基中所含的活菌数影响不是很大；从上表中的活菌数和芽孢率两方面综合分析，含水量为59%时对枯草芽孢杆菌生长有利；3.2 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响表 2 稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响稻草粗细程度活菌数 <10）芽孢率 <%）<0.5mm1588.50.5 1.0mm9.987.61.0 1.5mm1487.6>1.5mm9.789.9混合样1190.8通过对比观看，可以得出稻草粗细程度对培育基的活菌数和芽孢率的影响不是很明显，基本都处于一个数极的；但是在工业化生产中，粉碎稻草并区分不同的粗细程度，需要肯定的人力物力，从而提高了工厂的生产成本，不利于工业化生产，所以一般挑选稻草的粗细程度为混合样， 可以大大降低生产成本，而发酵培育基的活菌数和芽孢率又不低，有利于大规模化的工业生产；3.3 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响表 3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响培育基活菌数芽孢率欢迎下载精品学习资源一1.2×1090.6%二5.8× 1090.2%三1.2×1089.6%四7.4× 1088.4%五1.0×1033.5%六1.1×1091.2%七8.9× 1068.8%通过对比观看，可以发觉<NH）SO不利于培育基产芽孢，发酵48h 后的培育基的芽孢率都比较低；而蛋白胨和酵母膏对培育基的活菌数和芽孢率影响相差不大，其中用尿素作为氮源时，培育基的活菌数和芽孢率都很高，而且尿素的价格较其它几种氮源都要低，可以降低生产成本，有利于工业化的生产；3.4 碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响表 4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响碳源活菌数 <109）芽孢率 <%）葡萄糖1290.7蔗糖1189.8玉 M 粉2492.3玉 M 淀粉4.960.5大 M 粉3737.6通过对比观看，可以得出葡萄糖和蔗糖对培育基中的活菌数和芽孢率的影响差不多，而大M 粉有利于枯草芽孢杆菌的生长，但产生芽孢少，发酵后培育基的芽孢率低；综合考虑发酵后培养基中的活菌数和芽孢率，可以明显地得出玉M 粉作为碳源时对枯草孢芽杆菌的生长和产芽孢都有利，适合于大规模化的工业化生产；3.5 碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响表5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响碳氮比活菌数 <1010）芽孢率 %>0:10.00000420.11:31.791.21:22.490.81:13.092.72:14.193.53:12.891.74:12.592.15:12.292.67:11.593.11:00.00000319.2欢迎下载精品学习资源通过对比观看，可以发觉当发酵培育基中只有碳源和氮源中的一种时，发酵后检测出的活菌数和芽孢率都不是很抱负，都很低，不利于生产；而假如培育基中碳源和氮源都有时，可以看动身酵后培育基的芽孢率相差不大；而对于大规模化的工业生产，需要的是活菌数和芽孢率都高的生产配方，当碳氮比为 2:1可以满意生产需求；3.6 pH 对枯草芽孢杆菌生长的影响通过对比观看，可以发觉pH 值对培育基的芽孢率影响不大，基本上都在90%左右， pH 值主要是影响培育基的活菌数；综合表中的活菌数和芽孢率两项指标，得出pH 值为 7.5时培育基的活菌数和芽孢率都很高，符合规模化的工业生产；4 争论本课题以农作物的副产品为培育基的基础物料，在前人争论的基础上，采纳单因素试验和正交试验相结合的方法，对枯草芽孢杆菌的固体发酵培育基进行争论；争论说明枯草芽孢杆菌的最佳发酵培育基为麦麸45% ，稻草 49.05% ，玉 M 粉 2.25% ，尿素 0.9%， CaCO1.8% ， KHPO表6 pH 对枯草芽孢杆菌生长的影响pH活菌数 109>芽孢率 %>5.51.287.56.08.890.46.51891.37.03292.87.55394.58.02194.98.58.995.21.0%，水含量 57%， pH 7.8.枯草芽孢杆菌的应用特别广泛，在工业和农业上都有特别好的进展前景，对枯草芽孢杆菌培育基的争论也有很大的空间；参考文献1 刘惠知，孔利华，周映华，黄建军 .益生菌枯草芽孢杆菌发酵培育基及条件的优化M.科技动态 .2 孙笑非，孙鸣 .一株枯草芽孢杆菌发酵培育基的优化 M.爱保生论坛 .3 郭小华，陆文清，邓萍，黄德仕.益生枯草芽孢杆菌 MA139 增殖培育基的优化欢迎下载精品学习资源M.中国农业高校学报 .2006 ,11 3> : 41-46.4 惠明，窦丽娜， 田青，侯银臣枯草芽孢杆菌的应用争论进展安徽农业科学， Journal of Anhui Agri. Sci. 2021，36 27> :11623 - 11624， 116275 惠明，窦丽娜，田青，侯银.枯草芽孢杆菌的应用争论进展M.安徽农业科学.Journal of Anhui AgriSci 2021. 3627> ：11623一11624，11627.6 张志焱 ,徐海燕 ,杨军方 .枯草芽孢杆菌固体发酵培育基的优化M.工艺与设备.7 吴玲 ,何颖 .瑞士乳杆菌增菌培育基的挑选J.常州工程职业技术学院学报, Vol. 4 2007 December No.54.8 田晓丽，赵红杰，唐彩乐 .生防放线菌 153固态发酵条件的优化及其耐热力检测J.西北农林科技高校学报 <自然科学版） , Vol.38No.7 Ju.1.2021.9 朱强,夏艳秋 ,董克克 .响应面法优化灵芝药性固体发酵培育基J.中国生物工程杂志 , 2021 ，30 9> : 75-79.10 TIMMONSM B, LOSORDO TM. Aquaculture water reuse systems. Engineering design and management M. 2nd edition.Amsterdam. Elsevier, 1997.11 Panagiot ou G, Olavarria R, Olss on L. Penicillium brasilianum as anenzyme factory ； the essential role of feruloyl esterases for the hydrolysis of the plant cell wall . JB iotech, 2007, 130 3> : 219 228.12 许俊杰 , 钟文文 . LY424 细菌菌株产红色素条件的优化 自然科学版 > , 2021, 41 1> : 39 44.J.山东农业高校学报13 冯宇，高年发，张颖 .短乳杆菌生产 - 氨基丁酸培育基的优化J.现代食品科技, 2021, Vol.26, No.1.14 张蕾,石新丽 ,李敏.短小芽孢杆菌 TY079 产抗菌物质的发酵培育基争论N.河北省科学院学报 , Vol. 27 No. 2 Jun. 2021.15 丁翠珍 ,裘季燕 ,刘伟成 .枯草芽孢杆菌 B02 产生拮抗物质培育基及发酵条件优化J.中国生物防治 ,2021 年5 月.17 张蕾 ，张铎 ，张丽萍等 .枯草芽孢杆菌 BSD-2 产抗菌肽发酵培育基的优化J.食品科学 ,2021, Vol. 31, No. 03 189.18 Xu J, Chen S W, Yu ZN. Optimization of process parameters for poly- glutamate pr oducti on under solid state fer mentati on from Bacillussubtilis CCTCC202148. Pro B iochem , 2005, 40> : 30753081 19RAMKR IS HNA S , S WAMI NMHAN T. Respon sesurfacemodeling and optimi zation to eluci date and analyztheeffects of inoc u lu ms age and size onsurfact i n production J. Biochem ical Engineering Journ a, l 2004, 21: 1412148.欢迎下载精品学习资源评语：欢迎下载精品学习资源指导老师：2021 年月日青海师范高校生命与地理学学院欢迎下载