2022年淋巴细胞杂交瘤克隆抗体技术.docx

精品学习资源淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术撰写刘雪松1975 年， Kohler和 Milstein发觉将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术；这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础讨论开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治供应了新的工具；制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列试验步骤，下面依据制备单克隆抗体的流程次序，逐一介绍其试验方法；细胞融合前预备细胞融合，选择杂交瘤抗体的检测杂交瘤的克隆化和冻存单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定影响因素、失败缘由分析一、细胞融合前预备 一免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的胜利，获得高质量的McAb至关重要；一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开头初次免疫，免疫方案应依据抗原的特性不同而定；1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫成效；下面以细胞性抗原为例的免疫方案 :初次免疫1×10 0.5ml ip 腹腔内注射 2 3 周后其次次免疫1×10 0.5ml ip3 周后加强免疫 融合前三天 1×10 0.5ml ip或 iv 静脉内注射 取脾融合欢迎下载精品学习资源2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂；要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易立刻扩散呈小滴状说明已达到油包水的状态；商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀；初次免疫Ag1 50 g加福氏完全佐剂皮下多点注射 一般 0.8 1ml0.2ml 点 3周后其次次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ipip剂量不宜超过 0.5ml3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip 5 7 天后采血测其效价，检测免疫成效2 3 周后加强免疫，剂量50 500 g 为宜， ip 或 iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原 特殊是一些弱抗原 的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量；转变抗原注入的途径，基础免疫可直接采纳脾内注射；使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性； 二饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，很多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞选择、克隆化和扩大培育过程中，加入饲养细胞是非常必要的；常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 较为常用 、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3 经放射线照耀后作为饲养细胞，使用比较便利，照耀后可放入液氮罐长期储存，随用随复苏；小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采纳与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb c 小鼠 6 10 周龄欢迎下载精品学习资源拉颈处死浸泡于 75酒精，消毒 3 5 分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入6 8ml 培育液反复冲洗，吸出冲洗液放入 10ml 离心管， 1200 转分别心 5 6 分钟用 20小牛血清 NCS或胎牛血清 FCS 的培育液混悬，调整细胞数1×10 ml加入 96 孔板， 100 l 孔放入 37CO2 孵箱培育6一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得58×10腹腔巨噬细胞，如用小鼠胸66腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×10 ml ，小鼠脾细胞为1×10 ml ，小鼠的成纤维细胞3T31 ×10 5 ml，均为 100 l 孔； 三骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb；常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2 0、X63 Ag8.653等；骨髓瘤细胞的培育适合于一般的培育液，如RPMI1640，DMEM培育基；小牛血清的浓度一般 在 10 20，细胞的最大密度不得超10 ml，一般扩大培育以110 稀释传代，每 3 5 天传代一次；细胞的倍增时间为16 20 小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或稍微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞；欢迎下载精品学习资源一般在预备融合前的两周就应开头复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏锐性，每3 6 月应用 8AG8 氮杂鸟嘌呤 选择一次，以防止细胞的突变；保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形状，活细胞计数高于95，也是打算细胞融合的关键； 四免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B 淋巴母细胞棗浆母细胞；一般取最终一次加强免疫 3 天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的胜利率较高；脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培育液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的 倍，细胞数为× 10左右；二、细胞融合，选择杂交瘤 一细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2 0， 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用不完全培育液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培育液洗涤2 次；(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培育液洗涤2 次；(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按110 或 15的比例混合在一起，在50ml 塑料离心管内用不完全培育液洗1 次， 1200rpm,8分钟；(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度；(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；(6) 在室温下融合 :30 秒内加入预热的1ml45 PEGMerek, 分子量 4000 含 5 DMSO，边加边搅拌；作用 90 秒钟，如冬天室温较低时可延长至120 秒钟；加预热的不完全培育液，终止PEG作用，每隔分钟分别加入1ml ， 2ml ， 3ml ， 4ml ， 5ml 和 10ml ；(7) 离心， 800rpm ， 6 分钟；(8) 弃上清，先用 6ml 左右 20 小牛血清 RPMI1640 轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开；欢迎下载精品学习资源(9) 依据所用 96 孔培育板的数量，补加完全培育液，10ml 一块 96 孔板；(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96 孔板， 100 l 孔， 37、 5 CO2 孵箱培养；7一般一块 96 孔板含有 1×10 脾细胞； 二HAT选择杂交瘤应用 HAT 选择培育液选择杂交瘤细胞的原理已在讨论生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加 HAT选择培育的时间和浓度；一般在融合 24 小时后，加HAT选择培育液； HT 和 HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml 加入 50ml20 小牛血清完全培育液中；由于在培育板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200 l 孔；所以在加选择培育液时应加 3 倍量的 HAT；我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2 3 进行选择，可得到中意的选择结果；50×HAT-3H:5×10M-5A:2×10M-4T:8×10M一般选择 HAT选择培育液维护培育两周后，改用HT 培育液，再维护培育两周，改用一般培育液；三、抗体的检测选择杂交瘤细胞通过选择性培育而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体；一般在杂交瘤细胞布满孔底1 10 面积时，即可开头检测特异性抗体，选择出所需要的杂交瘤细胞系；检测抗体的方法应依据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的选择方法，一般以快速、简便、特异、敏锐的方法为原就；常用的方法有 :1. ELISA 用于可溶性抗原 蛋白质 、细胞和病毒等McAb的检测；2. RIA 用于可溶性抗原、细胞McAb的检测；欢迎下载精品学习资源3. FACS荧光激活细胞分类仪 用于检查细胞表面抗原的McAb检测；4. IFA 用于细胞和病毒McAb的检测；上述方法均为一般试验室的常规方法，故在此不介绍详细的试验过程；牢靠的选择方法必需在融合前建立，防止由于方法不当贻误整个选择时机；四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化； r 为经过 HAT选择后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆；在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体 特异性抗体 分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞；要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化；克隆化的原就是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否就抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，由于抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失；即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丢失产生抗体的才能； 一克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法；1. 有限稀释法的程序制备饲养细胞悬液 同融合前预备 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在15×10 ml取 130 个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培育液，即20 个细胞 ml， 100 l 孔加A、B、C三排为每孔2 个细胞；余下 2.9ml细胞悬液补加 2.9ml 含饲养细胞的完全培育液, 细胞数为 10 个 ml， 100 l 孔加 D、E、F 三排，为每孔 1 个细胞；余下 2.2ml 细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培育液，细胞数5 个 ml， 100 l 孔，加 G、H两排，为每孔 0.5 个细胞；培育 4 5 天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培育液200 l 孔；第 8 9 天时，肉眼可见细胞克隆，准时进行抗体检测；注: 初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培育液中加HT；2. 软琼脂法软琼脂的配制欢迎下载精品学习资源含 20 FCS小牛血清 的 2 倍浓缩的 RPMI1640 1琼脂水溶液：高压灭菌， 42预热；0.5 琼脂：由 1 份 1琼脂加 1 份含 20 小牛血清的 2 倍浓缩的 RPMI1640 配制而成；置42保温；用上述 0.5 琼脂液 含有饲养细胞 15ml 倾注于直径为 9cm 的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用；按 100 ml， 500 ml 或 5000 ml 等浓度配制需克隆的细胞悬液；1ml 0.5琼脂液 42 预热 在室温中分别与1ml 不同浓度的细胞悬液相混合；混匀后立刻倾注于琼脂基底层上，在室温中10 分钟，使其凝固，孵育于37， 5 CO2孵箱中；4 5 天后即可见针尖大小白色克隆，7 10 天后，直接移种至含饲养细胞的24 孔板中进行培育；检测抗体，扩大培育，必要时再克隆化； 二杂交瘤细胞的冻存准时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是非常重要的；由于在没有建立一个稳固分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培育过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体才能的丢失等等；假如没有原始细胞的冻存，就由于上述的意外而全功尽弃；6杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原就上细胞应在每支安瓿含1×10以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培育环境不同而转变，在24 孔培育板中培育，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿；细胞冻存液 : 50 小牛血清40 不完全培育液10 DMSO二 甲亚砜 冻存液最好预冷，操作动作轻柔、快速；冻存时从室温可立刻降到0，再降温时一般按 每分钟降温23，待降至 - 70可放入液氮中；或细胞管降至0 后放 - 70超低温冰箱，次日转入液氮中；也可以用细胞冻存装置进行冻存；冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳固性，在液氮中细胞可储存数年或更长时间；欢迎下载精品学习资源五、单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1. 体外使用旋转培育管大量培育杂交瘤细胞，从上清中猎取单克隆抗体；但此方法产量低，一般培育液含量为10 60 g ml，假如大量生产，费用较高；2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清；7实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按13×10 ml 接种于小鼠背部皮下，每处注射 0.2 ml,共 2 4 点；待肿瘤达到肯定大小后 一般 10 20 天 就可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg ml；但采血量有限；6腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷 或液体石腊于 BaLb c 鼠， 1 2 周后腹腔注射 1×10 个杂交瘤细胞，接种细胞7 10 天后可产生腹水，亲密观看动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获 1 10ml 腹水；也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次；腹水中单克隆抗体含量可达 5-20mg/ml ， 这是目前最常用的方法，仍可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔就产生腹水快、量多；六、单克隆抗体的鉴定对制备的 McAb进行系统的鉴定是非常必要的；应对其做如下方面的鉴定:1. 抗体特异性的鉴定：除用免疫原 抗原 进行抗体的检测外，仍应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA 法；例如制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，仍应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便选择肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体；制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应第一考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉；2. McAb的 Ig 类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的其次抗体进行选择时，已经基本上确定了抗体的 Ig 类型；假如用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠 IgG 或 IgM，就检测出来的抗体一般是 IgG 类或 IgM 类；至于亚类就需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心 ELISA 来确定 McAb的亚类；在作双扩试验时，如加入适量的 PEG3 ，将有利于沉淀线的形成；3. McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的爱护试验来确定McAb的生物学活性；例如假如确定抗病毒McAb的中和活性，就可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏锐的细胞，来观看动物或细胞是否得到抗体的爱护；4. McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同；5. McAb亲和力的鉴定：用ELISA 或 RIA 竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力；欢迎下载精品学习资源七、影响因素、失败缘由分析由于制备 McAb的试验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不留意就会造成失败；其主要失败缘由和影响因素有:1. 污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染；这是杂交瘤工作中最辣手的问题；一旦发觉有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培育环境；支原体的污染主要来源于牛血 清，此外，其它添加剂、试验室工作人员及环境也可能造成支原体污染；在有条件的试验室， 要对每一批小牛血清和长期传代培育的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应准时实行措施处理；对于污染的杂交瘤细胞可以实行生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB c 小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖菌取出分别杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染；2. 融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑以下因素PEG有毒性或作用时间过长；牛血清的质量太差，用前没有进行严格的选择；骨髓瘤细胞污染了支原体； HAT 有问题，主要是A 含量过高或HT 含量不足；3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中 A 失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成 A 抗击细胞所致；有可能是免疫原抗原性弱，免疫成效不好；对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长；也可能发生染色体丢失；Goding91982 曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施；三要 :要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管；要应用倒置显微镜常常检查细胞的生长状况；要定期进行再克隆；三不要 :不要让细胞“过度生长”；由于非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞；不要让培育物不加检查地任其连续培育几周或几个月；不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代；欢迎下载精品学习资源4. 杂交瘤细胞难以克隆化可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以胜利；如是融合后的早期克隆化，应在培育液加HT；欢迎下载