公子小丑鱼的人工繁殖,胚胎发育及不同盐度对其幼鱼生长的影响.doc

. .学校代码：研究生学号10264M100101041上 海 海 洋 大 学硕士学位论文 题 目：公子小丑鱼Amphiprion ocellaris胚胎发育的形态学观察及盐度对幼鱼生长的影响英文题目：Morphological observation of embryonic development and effects of salinity on growthofFalse clownfishAmphiprion ocellaris专 业：水产养殖研究方向：海水欣赏鱼繁殖与发育姓 名：鞠晨曦指导教师：蔡生力 李云 二O一三 年 四月 九 日 XX海洋大学学位论文原创性声明本人X重声明：我遵守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进展研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承当。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日XX海洋大学学位论文使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权XX海洋大学可以将本学位论文的全部或局部内容编入有关数据库进展检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 ，在 年解密后适用本书。本学位论文属于 不XX 学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日. .word. .公子小丑鱼Amphiprion ocellaris胚胎发育的形态学观察及盐度对幼鱼生长的影响摘 要公子小丑鱼，学名为眼斑双锯鱼，海葵鱼属(Amphiprion)，雀鲷科(Pomacentri- dae)，鲈形目Perciformes。公子小丑鱼是最常见的海洋欣赏鱼类，雌雄同体，雄性先熟，分布于西太平洋礁岩海域。公子小丑鱼以其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及得意的形象而深受水族爱好者的喜爱。挑选适宜的野生的公子小丑鱼个体在实验室条件下进展配对，调控适宜的外界环境因子并进展营养强化使其产卵，产卵以后进展人工孵化。仔鱼在孵出的第2d即开口食用由小球藻(Chlorella sp)强化的褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis),全长4.24.4mm,为仔鱼期，46d变态为稚鱼,全长5.15.4mm;开场投喂刚孵出的卤虫无节幼体,10d以后开场投喂经小球藻强化的卤虫(Artemia sp)，1622d 进入幼鱼期,全长10.012.4 mm，3545d开场投喂自制人工配合饵料。在实验室水温26±1、盐度28±1的条件下，对公子小丑鱼胚胎发育过程中的形态学变化进展了观察研究。结果说明，公子小丑鱼受精卵属附着性卵，呈长椭圆形,长径2.0mm±0.1mm，短径0.95mm±0.1mm；其卵裂方式为端黄卵盘状卵裂；胚胎发育可分为10个主要阶段：卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成期和孵化期。发育过程中胚胎的颜色逐渐加深，呈现由橙黄色到棕黄色的变化；在26水温条件下，整个胚胎发育过程需200h左右。在水温26±1的条件下,研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体mRNA水平的影响。第42d和70d的试验结果都说明, 公子小丑鱼幼鱼在各盐度实验组成活率无显著差异; 当盐度为25和30时生长最快,盐度20时次之,盐度15和35时较慢;与之相应的饵料转换效率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低;相对体重增长率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低。第70d时取样进展分子生物学实验，结果说明，公子小丑鱼脑垂体GHmRNA水平在盐度15时最高，盐度25次之，盐度20、30、35时较低;肝脏GHR1mRNA水平在盐度20、25、30时最高，盐度35次之，盐度15时最低;肝脏GHR2mRNA水平在盐度25时最高，盐度20时次之，盐度30、35、15时较低。公子小丑鱼幼鱼GHR1和GHR2mRNA表达量与其生长呈正相关。说明公子小丑鱼幼鱼最适宜的生长盐度为25到30。关键词：公子小丑鱼，胚胎发育，形态学，盐度，成活率，生长，生长激素，生长激素受体Morphological Observation of Embryonic Development and Effects of Salinity on GrowthofFalse clownfishAmphiprion ocellarisABSTACTSFalse clownfish is placed in Amphiprion ocellaris, Pomacentridae, Perciformes. It is a kind of mon marine ornamental fish, hermaphrodite and cross-fertilization and widespread in the sea of south China, Philippines and the western Pacific. False clownfishis a popular fish forornamental fish enthusiasts for the bright colore, beautiful pattern and lovely figure. The fish was collected from the wild as broodstock, and cultured to mature and spawned in artificial condition. The larval fish could be fed rotifer strengthened by unicellular algaechlorella spp. in the next day after hatching and developed into juvenile at 46 days after hatching,newly hatchedArtemianauplii were supplied, from the 10th day Artemia nauplii strengthenby chlorella spp.were supplied, then developed into parr 1622 days after hatching. The parrs could be fed by artificially madepound feed at 35 45 days after hatching.The study was carried out to investigate the incubation period and the changes of morphological character during the embryonic development of Amphiprion ocellaris at water temperature (26±1),salinity(28±1)in laboratory condition. It was found that the eggs belonged to the telolecithal and were subject to discoidal cleavage;The adhesive fertilized eggs, which were ellipsoidal, were2.0mm±0.1 mm long and 0.95mm±0.1mm in diameter;The process of embryonic development could be divided into ten stages: pre-cleavage stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, somite stage, turnover stage, angiogenesis stage, organ formation stage and hatching stage. The color of the embryo changed gradually during the development procession, from orange-yellow to claybank. The whole incubation period is about 200h at water temperature 26. The effects of salinity on growth, feeding, food conversion rate (FCR), growth hormone and receptor mRNA leve of young Amphiprion ocellariswere studied. Theresults of the 42th and 70th day showed that there is no significant effect on the survive rate for young Amphiprion ocellarisat each salinity levels. The young Amphiprion ocellarishad a highest growth at the 25 and 30 salinity levels, higher growth at 20 and low growth at 15 and 35. The feed conversion ratio is also higher at the 25 and 30 salinity levels and then reduced along the 20, 35, 15 salinity levels. The growth rate of relative body weight is conformed to this law. The molecular biology study began at the 70th day, the result showed that the highest level of pituitary GHmRNA was at salinity 15 and higher at 35, the lowest level was at salinity 20, 30, 35. The highest level of hepar (liver) GHR1mRNA was at salinity 20, 25, 30 and higher at 35, the lowest level was at salinity 15. The highest level of hepar GHR2mRNA was at salinity 25 and higher at 20, the lowest level was at salinity 15, 30, 35. The expression of GHR1mRNA and GHR2mRNA positively correlated with growth.The most suitable salinity range is 2535. Key words: false clownfish;Amphiprion ocellaris;embryonic development; morphology;salinity;growth;GHmRNA;GHR1mRNA; GHR2mRNA目 录摘 要IABSTACTSIII引 言11. 小丑鱼分布和生活习性12. 交配产卵33. 人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响34.荧光定量方法45.繁殖生产中存在的问题5第一章 公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖61 材料与方法61.1亲鱼养殖模式61.1.1 亲鱼养殖系统61.1.2 亲鱼的来源71.1.3 亲鱼的暂养71.1.4 亲鱼的配对71.1.5 亲鱼的培养71.2幼体培育系统71.3 培育用水81.4 生物饵料培养81.5 仔幼鱼对饵料的需求82.1 亲鱼产卵82.2 受精卵人工孵化92.3 仔幼鱼的孵化率和成活率103讨论10第二章 公子小丑鱼胚胎发育的形态学观察131 材料与方法131.1 实验用鱼和养殖管理131.2 胚胎发育观察132 结果与分析142.1 卵裂前期152.2 卵裂期1h162.3 囊胚期5h162.4 原肠期10h162.5 神经胚期20h202.6 体节期22h202.7 翻转期35h202.8 血管形成期56h212.9 器官形成期72h212.10 孵化期199h213 讨论223.1 胚胎发育过程223.2 孵化时间223.3 胚胎颜色的变化23第三章 盐度对公子小丑鱼幼鱼生长和生长激素及其受体mRNA水平的影响241 材料与方法241.1 实验材料241.2 实验方法241.2.1 生长、成活率、摄食实验241.2.2 生长激素及其受体mRNA水平实验251.2.2.1 总RNA的提取251.2.2.2 反转录及引物设计251.2.2.3 常规PCR261.2.2.4 荧光定量PCR 扩增261.3 数据分析262 结果272.1 不同盐度对公子小丑鱼幼鱼成活率的影响272.2 不同盐度对公子小丑鱼幼鱼生长及摄食的影响272.3 荧光定量PCR分析312.4 公子小丑鱼生长激素及其受体mRNA基因与-actin mRNA 基因的荧光定量PCR标准曲线332.5各盐度组垂体GHmRNA相对表达量353 讨论363.1盐度变化对公子小丑鱼幼鱼存活与生长的影响363.2 盐度变化对公子小丑鱼幼鱼生长激素及其受体mRNA水平的影响36小 结38参考文献39攻读硕士期间发表的论文43致 44. .word. .引 言公子小丑，海葵鱼属(Amphiprion)，雀鲷科(Pomacentridae)，鲈形目Perciformes。分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域。性成熟后雌鱼体形比雄鱼大。野生雌性成体体长10-12cm，人工水族缸养殖体长多不大于10cm。体色橘红，椭圆形，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘，喜欢躲在海葵中。公子小丑鱼由于其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及得意的形象而深受水族爱好者的喜爱。从1997到2002，公子小丑鱼占据了世界欣赏鱼类鱼类总出口量15.6%和欧洲国家进口份额的25%以上1。海水欣赏鱼也占到美国渔业贸易出口总额的20%，价值约8.9亿美元Johunstou2。迪士尼动画大片?海底总发动?的热播更是让公子小丑鱼“尼莫成为家喻户晓的明星，也使其销量增加了两倍。随着经济的飞速开展和人民对精神文化需求的提高，海水水族缸在2000年后开场在国内兴起并飞速开展，目前在国内大中城市，海水欣赏鱼店如雨后春笋般出现。由于受人工繁殖技术和生产规模的局限，目前市场上销售的公子小丑鱼仍以捕捞野生自然群体为主，并多用氰化物等有毒化学品进展捕捞，采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，能够作为商品进入市场的缺乏20%3，而且氰化物还会伤害无法逃避的珊瑚等海洋生物，破坏珊瑚礁区的生态平衡，所以海水欣赏鱼的大规模商业化人工繁育就变失势在必行。目前国内外已有不少学者对公子小丑鱼的生理生态、繁殖发育做了初步研究4-7，并成功进展了人工育苗和批量化生产，但规模仍较小，满足不了市场所需。1. 小丑鱼分布和生活习性小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，是一种热带海洋鱼类。有28种，一种来自棘颊雀鲷属Premnas，其余来自双锯鱼属Amphiprion。小丑鱼与海葵有着密不可分的共生关系，因此又称海葵鱼。带毒刺的海葵保护小丑鱼，小丑鱼那么吃海葵消化后的残渣，形成一种互利共生的关系。（1） 形态特征：背棘(总数)，12 - 12；背的软条 (总数)，14 - 16；臀棘 2；臀鳍软条，1415，稚鱼全体是黑色的；前额与上侧面上有白色的斑块；所有鳍的外缘都是黑色。成鱼的地理分布和颜色是可变的。见图1图1 公子小丑鱼Fig.1 Amphiprion ocellaris2生态习性及食性：栖息于珊瑚礁与岩礁，常与大的海葵，海胆或小的珊瑚顶部共生。形成小群到大群鱼群。胃内含物包括藻类，桡足类及其他的浮游性甲壳动物。3常见种类：公子小丑：分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域，属雀鲷科，体长10-12cm，椭圆形。体色橘红，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘。红小丑：Amphiprion frenatus，地理分布分布在西太平洋的珊瑚礁海域，分布X围包括泰国湾至帕劳群岛西南部，北至日本南部，南至印度尼西亚的爪哇一带海域。成鱼体呈椭圆形而侧扁，吻短而钝。眼中大，上侧位。口大，上颌骨末端不及眼前缘；齿单列，齿端具缺刻。背鳍单一，软条部延长而呈方形；尾鳍呈扇形，上下叶外侧鳍条不延长呈丝状。成鱼体黑色，头部、胸腹部以及身体各鳍均为红色。眼睛前方具一镶白缘之宽白带，向下延伸至喉峡部。亚成鱼体一致橙黄色，眼睛前方具一白色竖带。随着成长，体色逐渐转红，且身体前方出现黑斑并扩散至整个身体。透红小丑鱼：Premnas biaculeatus，分布于印度洋、太平洋的珊瑚礁海域，属雀鲷科，体长10-15cm，椭圆形。全身紫黑色，各鳍紫红色，体侧在眼睛后、背鳍中间、尾柄处有三条银白色环带。小丑鱼也通常被叫为海葵鱼,与特定的海葵组成一种互利共生的关系。一个大的海葵直径为一米可以庇护多达30多个各种大小的小丑鱼。所有的小丑鱼都是雄性先熟的雌雄同体鱼，开场是雄性后来变为雌性。与其它雀鲷科鱼类的成对关系不一样的是，大局部小丑鱼种类都是永久的一夫一妻制。雌雄的结合非常严密直到其中的一个成员消失时才会被打破。在大局部情况下，雌性的死亡更普遍，因为雌性一般是最大和最老的个体，当一个小丑鱼家族的的雌鱼死亡后，雄鱼会转化为雌鱼，与此同时优势的未成熟的雄鱼就会转化为成熟的雄鱼，这个过程通常需要几个月到一年才能彻底完成，而且这个过程是不可逆的8,9。小丑鱼在深海产卵，把单层的卵产到坚硬的基面上。在自然环境中，海葵会戒备着卵使之不受外界侵扰，因为卵在海葵的管辖X围之内。亲鱼通常都照顾受精卵直到幼鱼孵出。用鳍条扇动的行为使围绕在巢穴的水富含氧气，同时用嘴去除受损和坏掉的卵以保证安康的卵不被污染10。2. 交配产卵公子小丑鱼典型的产卵信号是亲鱼在产卵前约3-4小时清洁陶罐内部的污点。在此期间，雌性的产卵器，一个白色的小管，从肛门附近的微孔延伸出来。根据对于小丑鱼的产卵观察，透红小丑鱼一般在上午十一点左右产卵，而公子小丑一般在下午产卵，时间不定。雄鱼积极的参与瓦罐的清洁工作而雌鱼在产卵前0.5-1h更积极参与瓦罐的清理。在第一批10到20个卵被产出后，雌鱼将在产下下一批卵之前仔细检查这批卵。这些卵被产在陶罐的内壁并呈圆形排列。雌鱼产卵后，雄鱼肛门孔扩大对卵进展受精。雄鱼在卵上游动并用生殖器触碰卵。这种行为在鱼进展下一组鱼产卵前通常重复2-3次。刚产的卵为橙黄色，长椭圆形(2.0×1.0mm),而且在卵黄的中部成轻微的弧形。卵可以通过外壳看到因为卵膜是透明的。卵黄呈鲜亮的橙色，同时油滴清晰可见。3. 人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响目前对于海水欣赏鱼的专业性研究相对较少，主要集中在生活习性11,12、分布13,14、分类、生理、人工繁殖与发育等的研究。能够实现人工繁殖的也仅限于虾虎科、拟雀鲷科和雀鲷科的几个品种，虾虎科有金灯虾虎Elacatinus sp、蓝灯虾虎Elacatinus oceanops15等，拟雀鲷科有美国草莓Pseudochromis fridmani16、蓝线Pseudochromis springeri、日出龙Pseudochromis flavivertex17等，雀鲷科主要就集中在小丑鱼身上，小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，已发现的小丑鱼约有28种，目前报道能够人工繁育的有十几种。虽然在海水水族缸里人工养殖小丑鱼历史已有几十年, 而且早在1978年Ross就研究了黑红小丑(Amphiprion melanopus)的繁殖习性18，但对小丑鱼进展人工繁殖和发育的相关研究主要在近十年。2000年M.Arvedlund等研究了黑红小丑的光周期对黑红小丑(A.melanopus)仔稚鱼生长的影响19，2001年Ignatius等研究了一种黑双带小丑A.sebae的人工繁育技术20，2002年Madhu报道了黑边公子小丑(A.percula)的人工繁殖21，2004年Bridget报道了黑红小丑(A.melanopus)胚胎发育和耗氧量之间的关系22，2005年Ho描述了银边小丑(A.perideraion)亲鱼的繁殖行为以及胚胎发育及幼体培养23；Sukjai描述了鞍背小丑(A polymnus)的胚胎发育24；滕力平等简述了二线小丑的人工繁殖和胚胎发育25；Aratake先后研究了将红双带小丑(A.clarkii)暂养在日本九州岛的西、南两个海域中产卵卵径及数量的季节性变化和卵径与蕴含能量之间的关系26,27，2006年LJLIEW和何兴源分别报道了公子小丑实验室条件下的胚胎发育和生殖行为与育苗5,6，2007年Yasir报道了公子小丑鱼(Aocellaris)繁殖习性及胚胎和仔鱼的发育4，2021年鲍鹰等先后对红小丑(A.frenatus)人工育苗与胚胎发育和透红小丑P biaculeatus人工繁殖与育苗进展了初步的研究28,29，2021年KVDhaneesh描述了黑边小丑(A percula)的胚胎发育30，2021年王斌对公子小丑鱼的人工繁育技术进展了初步的研究7，2021年Ye Le等报道了温度对红双带小丑(A.clarkii)幼鱼成活率、发育、生长的影响31，2021年K.V.Dhaneesh等报道了线小丑(A akallopisos)的繁殖、胚胎发育和耐盐性32。综上所述，十年来对于小丑鱼繁殖与发育的研究呈井喷之势，国内对于小丑鱼的研究也开场逐渐增多，随着对小丑鱼发育和繁殖机理的研究不断深入，相信小丑鱼的大规模商业化必将成为现实。4.荧光定量方法实时荧光定量PCRReal-time PCR技术由美国Applied Biosystems公司推出，它实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR具有特异性强，无污染，自动化程度高等优点，广泛应用于不同的研究领域。实时荧光定量PCRReal-time PCR技术是指在普通的PCR反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过构建标准曲线和目的及内参基因到达荧光阈值的CT值对未知模板进展定量分析。荧光化学材料可分为荧光染料和荧光探针两类。荧光染料主要以SYBR Green为主要代表，是非特异性荧光化学材料。SYBR Green 是荧光定量常用的染料，SYBR Green可以与扩增过程中形成的双链DNA结合并且发出荧光。在游离的状态下，SYBR Green只能发出非常微弱的荧光，但是SYBR Green与双链DNA结合之后，荧光的强度就可以增强到其在游离状态的1000倍以上。所以一个PCR反响中检测到的全部荧光信号与扩增得到的双链DNA量的是成正比例关系的，我们也就可以通过检测荧光信号计算出出PCR体系中扩增出来的的双链DNA的量。5.繁殖生产中存在的问题首先是人工配对的问题，亲鱼如和配对，如何挑选亲鱼，其次是配对后使用什么饵料才能促使亲鱼成熟并产卵，产卵后胚胎发育所需要的条件，如何人工孵化，孵化后幼鱼生长的最正确条件，比方用什么饵料、盐度、温度、光照、pH、溶氧、氨氮亚硝酸盐、海水中镁离子与钙离子的比例与含量等等还研究很少，并没有产生完整的操作规X。小丑鱼是雄性先熟的雌雄同体鱼，在生长过程中可能会经历由雄性向雌性的性逆转，性逆转的过程中主要由什么基因控制，也研究不多。本文的介绍了公子小丑鱼亲鱼的养殖模式及人工繁殖，观察了胚胎发育的形态学变化，并研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体mRNA水平的影响，以期为公子小丑鱼和其它海水欣赏鱼的大规模人工繁殖提供更多的理论依据。第一章 公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖1 材料与方法1.1亲鱼养殖模式1.1.1 亲鱼养殖系统 亲鱼培育系统共有上下四个玻璃缸，下面一个为过滤缸80×80×60cm。上面三个为养殖缸80×50×40cm。最上面一个养殖缸养羽毛藻来调控水质，中间两个养殖缸每个隔为三格，每格放入一个产卵罐供亲鱼产卵。 图1-1亲鱼养殖系统Fig.1-1 Broodstock breeding system1.1.2 亲鱼的来源 第一批亲鱼购自XX海水养殖研究所，以后的几批均购自XX花地湾水族市场，其来源为菲律宾和印尼的珊瑚礁海域。1.1.3 亲鱼的暂养 盐度为25-30，养殖水温为28±1，pH为8.0-8.1，光照2500-5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于25mg/L。1.1.4 亲鱼的配对 选择体长在8cm以上的作为雌鱼，体长7cm以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按1:1,1:2,1:N等。1.1.5 亲鱼的培养 控制亲鱼养殖水温为26±1，pH为8.0-8.1，盐度为27-29，光照2500-5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于50mg/L。水温通过水系统中加热棒控制。每天下午用虹吸管吸出缸底剩饵，及时补充因虹吸损失的水，每三天检测并调整一次盐度。在水系统中适量培养羽毛藻等水生植物来调控改善水质。每天投喂由鲜虾肉，鱿鱼，蛏子，冰冻卤虫，冰冻红虫，螺旋藻等混合而成的自制配合饵料。分别于上午10:00和下午4:00投喂2次。1.2幼体培育系统仔鱼，幼鱼养殖在800L的圆柱形塑料桶中，桶中央固定一个气石，温度用加热棒来控制。图1-2 鱼苗养殖容器模式图自X雅静Fig.1-2 sketch of barrel for larval culture图1-3 鱼苗养殖容器实体图Fig.1-3 entity of barrel for larval culture 1.3 培育用水 试验用水为以色列RED SEA海盐和淡水配制而成。1.4 生物饵料培养小丑鱼仔幼鱼生长所需要的生物饵料主要为轮虫和卤虫无节幼体。轮虫需要投喂小球藻才能存活和不断繁殖。卤虫无节幼体用幸运牌卤虫卵孵化得到，投喂时把虫体和卵壳以及没有孵化的虫卵别离。1.5 仔幼鱼对饵料的需求仔、稚鱼培养期间的水温控制在27±1，pH为8.0-8.2，盐度控制在27-29，氨氮量低于0.1 mg/L。仔鱼孵化后前三天投喂用小球藻强化的轮虫，轮虫的密度保持在1015个/ml左右。第四天开场投喂轮虫并开场投喂卤虫无节幼体，此期保证轮虫的密度保持在5个/ml左右，卤虫无节幼体的密度保持在3个/ml左右。第七天开场全部用卤虫无节幼体投喂，卤虫无节幼体的密度保持在5个/ml左右，第十天以后投喂用小球藻强化培养的卤虫，可根据稚鱼的体长培养大小相适应的卤虫。一个月后可以投喂小颗粒饲料和自制人工配合饲料。每天下午吸出缸底的污物，每天更换水体1/10的左右的水。2 实验结果 2.1 亲鱼产卵 公子小丑鱼亲鱼一般在白天产卵，产卵时雌鱼的输卵管明显伸长，雄鱼的输精管也伸长，雌鱼身体抖动，依次将卵粒排在瓦罐上，雄鱼以一样的动作排精，雌鱼身体抖动一次可产卵几十粒，然后雄鱼排精，以此往复几十次，鱼卵为粘性卵，排列严密，在瓦罐上形成大约3cm×5cm的卵块，产卵一般持续60min，平均产卵量为200500。图1-4 公子小丑鱼受精卵Fig.1-4 the fertilized egg of A. ocellaris2.2 受精卵人工孵化公子小丑鱼的胚胎发育在26度左右需要200h，产卵后160h眼睛开场变亮，反光性极强，这是判断孵化时间的重要标志。孵化当天用气石调节适量的气流吹动受精卵，以模拟亲鱼用鳍扇动受精卵，防止其缺氧死亡。孵化率在90%以上。图1-5 受精卵人工孵化Fig.1-5 Fertilized egg artificial incubation2.3 仔幼鱼的孵化率和成活率根据从2021年2月至9月对18批公子小丑鱼仔幼鱼的孵化率的统计，其孵化率高达93.23±5.56%。鱼苗前十五天的成活率如下图，孵化后当天成活率接近100%，第二天局部体质较差的鱼苗开场死亡，成活率大幅下降。孵化后的第四天局部生长快的鱼苗开场摄食卤虫无节幼体，而一局部体质较差，竞争力较弱的鱼苗由于无法摄食足够的轮虫，也开场局部死亡，使成活率有所下降。孵化后第十天，由于鱼苗在这个阶段很贪吃，有局部鱼苗撑死导致成活率降低。鱼苗在孵出的第2d，全长4.24.4mm,为仔鱼期，成活率为68.21±2.76%；第5d变态为稚鱼,全长5.15.3mm，成活率为39.67±3.34%;第15d开场进入幼鱼期,全长9.510.53 mm，成活率为20.35±1.78%。图1-6图1-6 鱼苗孵化后15d内成活率变化Fig.1-6 The survive rate change of the fry within 15 days after hatching3讨论公子小丑鱼雌性成熟时间较晚，由人工养殖爱好者报道的来总结，小丑鱼从人工孵化到产卵需要两年以上，所以购置人工繁殖三个月大的幼鱼来作为亲鱼配对周期太长。亲鱼的来源主要就集中于野外捕捞。野外捕捞又可分为网捕和药捕，网捕本钱较高，而且数量有限，所以市场上见到的大局部海水欣赏鱼都来自氰化钠捕捞，但是采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，公子小丑鱼暂养时如果处理不当会有超过80%在十天内死亡。由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，小丑鱼非常虚弱，这个时候不用喂食，并按水体体积滴入少量的水质稳定剂。由于其身体虚弱导致渗透压调节能力的降低，所以选择盐度为25-30，防止因盐度变化过快引起的应激。此时要保证水质尽量接近珊瑚礁海域的水平。由于一个野生小丑鱼家族中只有一只为雌鱼，有几条相对较大的为雄鱼，而大局部都是没有成熟的雄鱼。所以配对时应选择体长在8cm以上的作为雌鱼，由于由雄鱼变为雌鱼的过程是不可逆的，所以最好选择体长7cm以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按1:1,1:2,1:N等，一条雌鱼和多条雄鱼可以增加配对的成功率，配对成功的两条小丑鱼会共同生活在一个瓦罐里，并且会驱赶其他没有配对的雄鱼，这个时候就可以把没有配对的雄鱼捞出。 如何配对和促使亲鱼成熟产卵是公子小丑鱼繁殖过程中的难点，曾观察到配对后正在产卵的一对亲鱼中雄鱼死亡的情况，将另一对尚未产卵的雄鱼与此雌鱼配对，十天后新配对的亲鱼重新产卵。以此推测性成熟的雌鱼能刺激或加快未成熟的雄鱼性成熟，或者公子小丑鱼配对后未产卵的原因是雌鱼未性成熟，显然雌鱼是否性成熟对一对小丑鱼能否产卵起着更为关键的作用。充气对鱼卵的孵化非常重要，自然状况下鱼卵的胚胎发育需要亲鱼不断地用鳍扇动鱼卵来补充氧气，人工孵化时考虑到亲鱼养殖在循环水系统中，鱼苗孵化后会被水流带到过滤缸，所以附着有受精卵的产卵罐要拿出单独的充气孵化，气石充气的位置不对，会导致没有被气流吹动的受精卵缺氧白化死亡。所以，人工孵化时要调整气石和产卵罐处于一个适宜的位置，使所有的卵都能被气流吹动，而且尽量注意不要碰到孵化缸，以免产卵罐的位置发生偏移。气流的大小也有讲究，气流太大会导致没有到孵化时间的受精卵直接被气流吹掉，而气流太小又会导致受精卵的缺氧死亡。 公子小丑鱼的孵化时间会受到光照和温度等的影响。在适宜的X围内，温度越高，孵化时间越短。公子小丑一般在晚上的黑暗环境下孵化，如果孵化过程中受到外界光源的影响，会导致孵化时间推迟，孵化率降低。在公子小丑鱼人工育苗中,生物饵料的培养是一个非常重要的环节。公子小丑鱼仔鱼孵出之后, 卵黄囊已消耗