基因表达谱芯片筛选强直性脊柱炎差异表达基因的-第三军医大学学报(共5页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上基因表达谱芯片筛选强直性脊柱炎差异表达基因的研究张 莹，初同伟（重庆，第三军医大学新桥医院骨科）摘要目的 应用表达谱芯片比较人强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）组织与正常骶髂关节组织的基因表达差异，筛选AS疾病相关基因。方法 分别提取AS与正常简要添加病例来源，包括有：医院、科室、例数、诊断、性别、平均年龄（中位年龄）、入选时间段等骶髂关节的滑膜组织与椎旁组织的RNA，制备探针后用于表达谱芯片杂交，筛选AS组织差异表达基因，并采用半定量RT-PCR法验证芯片结果。结果 与正常组织样本相比，在AS组织中筛选获得差异表达基因237条，表达上调的已知基因91条，表达下调的已知基因78条；对其中20条基因进行半定量RT-PCR检测，结果与表达谱芯片结果一致。结论这类似一个技术方法的结论 利用表达谱芯片技术初步筛选出与AS相关的多个差异表达基因，为揭示AS的具体机制提供依据。关键词强直性脊柱炎；基因表达谱芯片；差异表达基因Screening differentially expressed genes in ankylosing spondylitis by cDNA microarrayZHANG Ying，CHU Tongwei（Department of Orthopedics， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing ，China）Abstract Objective To detect the differentially expressed genes between ankylosing spondylitis(AS) and normal tissues， and screen AS-associated genes via cDNA microarrays. Methods Total RNA was isolated from synovium and paravertebral tissues of both AS and normal sacroiliac joint， and used to construct hybridization probes. The probes were hybridized to the cDNA microarrays， and then the differentially expressed genes of AS were identified. Finally， semi-quantitative RT-PCR were applied to confirm the results of cDNA microarrays. Results 237 differentially expressed genes were detected from AS group with normal tissue as a reference， including 91 up-regulated kown genes and 78 down-regulated kown genes. semi-quantitative RT-PCR revealed the expression pattern of 20 candidate differentially expressed genes were consistented with the results of cDNA microarrays. Conclusion A number of AS-associated differentially expressed genes were detected via cDNA microarrays， and the present study will helpful to unveil the molecular mechanisms of ankylosing spondylitis.Key words ankylosing spondylitis； cDNA microarray； differentially expressed genesSupported by the National Natural Science Foundation of China()，Corresponding author：name？Tel：86- - ？；E-mail？基金项目 国家自然科学基金资助项目（）通讯作者初同伟，电话：(023) ，E-mail：chtwsina. com强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS) 是一种主要累及脊椎等中轴关节和肌腱、韧带骨附着点的慢性炎性疾病1，可引起脊柱骨性强直甚至中轴关节的活动功能丧失，导致严重的残疾。AS在中国人群中的发病率约为0.2%，患者多为青壮年，给患者及家庭带来沉重负担2。现有AS疗法多为对“症”治疗，难以取得满意的疗效；要实现对“因”治疗，需要明确AS的具体发病机制。文献报道不同人群和种族的AS患者都表现出与HLA-B27（human leukocyte antigen B27）的强相关性3，AS患者的 HLA-B27阳性率高达90%。但据统计B27阳性者的AS发病率不到5%，说明有B27以外的因素与发病有关4。还有学者认为AS 与细菌感染有关5，但至今未能在病变部位找到感染原，无法证实该观点。另有观点认为HLA-B27分子的错误折叠可能引发机体的自身免疫应答6，导致AS的发生。可作为讨论内容最近研究发现在活动期AS患者体内巨噬细胞集落刺激因子持续高表达，脊柱关节内有T细胞浸润，表明免疫细胞参与了AS的发病过程7。不同的研究报道表明AS有多种致病因素，但其具体分子机制尚不清楚。本研究拟采用表达谱芯片技术，研究AS组织的基因表达谱变化，筛选AS相关差异表达基因，为解析AS发病的分子机制和开展治疗提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本获得 选取本科室从2010年1月至8月收治的AS患者3例为试验组，男性2例，女性1例，平均年龄30.2岁，均为活动期（有炎性腰背痛，X骨盆平片提示：骶髂关节有明显骨化线，C-反应蛋白、ESR水平升高，HLA-B27阳性），符合1984年美国风湿病协会修订的纽约标准。选取本科室从2010年3月收治的脊柱骨折患者1例为对照组，男性，年龄32岁。试验组脊柱韧带和滑膜组织自关节置换术中取得，对照组脊柱韧带和滑膜组织自骨折切开复位术中取得。取样后用生理盐水迅速洗净组织表面，液氮保存。本实验采用程序严格遵循本院人体试验委员会制定的伦理学标准，同时获得该委员会批准，并征得全部患者的知情同意。1.1.2芯片和主要试剂 人基因表达谱芯片GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array购自Affymetrix公司，含47000个转录本和变异体，其中包括约39000个已知基因和6500个新基因。RNA提取试剂Plant RNAout购自Tiandz公司；One-step RNA PCR Kit购自Takara公司；RNeasy Micro Kit购自Qiagen公司；one-cycle cDNA Synthesis Kit、Sample Cleanup Module、IVT Labeling Kit、Gengchip Hybridization，Wash and Strain Kit购自Affymetrix公司；引物由Invitrogen公司合成。1.2 方法1.2.1 RNA提取 脊柱韧带和滑膜组织中含有大量的蛋白和多糖，尤其是多糖对分离RNA影响极大。采用常规动物组织RNA提取方法，难以获得高质量的总RNA。本实验采用提取植物组织总RNA的Plant RNAout试剂提取标本RNA，试剂盒基于改良CTAB法构建，可有效去除多糖。这类文字不适合出现在“方法”当中，可以放进“讨论”当中，请就事论事。实验按试剂说明书操作，实验流程作如下调整：组织块进行液氮研磨后，混合提取缓冲液转移到匀浆器中匀浆；匀浆产物进行两次氯仿抽提，加大离心转数、延长离心时间以去净沉淀；RNA沉淀用75%乙醇洗涤两次。1.2.2 探针制备及杂交 采用RNeasy Micro Kit纯化总RNA。采用one-cycle cDNA Synthesis Kit将纯化获得的mRNA合成为双链cDNA，并采用Sample Cleanup Module进行纯化。纯化的双链cDNA用IVT Labeling Kit合成cRNA。按照Gengchip Hybridization，Wash and Strain Kit进行杂交：首先将cRNA进行片段化，作为探针与芯片进行杂交（AS试验组进行3个生物学重复），最后依次洗脱芯片并染色。1.2.3数据分析 芯片扫描采用Affymetrix专用的Gene array Scanner 3000进行，应用GCOS软件进行数据分析。比较AS试验组与对照组芯片结果前，先将芯片所有探针组的信号进行“Normalize”处理，处理后的数据用于计算SLR值（signal log ratio，试验组与对照组取log2后的比值）。差异表达基因筛选严格按照如下标准：上调组SLR1（对应的比值为2），下调组SLR1（对应的比值为0.5）。1.2.4 RT-PCR验证芯片结果 根据芯片分析结果，选取差异表达基因并设计引物。以对照组和AS试验组总RNA为模板，按照one-step RNA PCR Kit方法对芯片筛选结果进行RT-PCR验证，实验重复3次。PCR产物电泳后进行灰度扫描并统计。2 结果2.1 RNA电泳及纯度检测样品RNA的D（260）/D（280）方法中未见介绍比值均在2.0左右，纯度高。经琼脂糖电泳可见清晰的28s、18s及5s条带（图1），完整性较好，符合芯片检测要求。 1 2 3 428s18s5s1：对照组；2： ；3： ；4： 图1 RNA电泳结果2.2 芯片分析结果按照设定的差异表达基因筛选标准，从3组芯片杂交结果筛选出在AS组织中的共同差异表达基因237条，其中明确基因功能的基因169条，功能不明确的序列68条。169条已知基因中，表达上调的91条(表1)，表达下调的78条(表2)。表1 AS组织中表达上调的部分基因题目缺乏自明性，必须兼备实验对象、实验条件、时相点、结果效应等基本因素，采用定语+主语或主语+谓语的语法形式，请重拟基因基因全称SLR 中英文全称？CRPC-reaction protein2.2TNF-tumor necrosis factor alpha2.1IL-1interleukin 11.3IL-6interleukin 62.0BMP-2bone marphogenic protein 22.4VEGFvascular endothelial growth factor1.7bFGFbasic fibroblast growth factor1.4Cbfa1core binding factor l2.2MMP3matrix metalloprotelnase 31.6HIF1hypoxia inducible factor 1 alpha1.8表2 AS组织中表达下调的部分基因题目缺乏自明性，必须兼备实验对象、实验条件、时相点、结果效应等基本因素，采用定语+主语或主语+谓语的语法形式，请重拟基因基因全称SLR中英文全称？ HBDhemoglobin， delta-1.6IGF-1insulin-like growth factors 1-1.7sTNFRsoluble tumor necrosis factor receptor-1.4IL-Rainterleukin-1 receptor antagonist-1.0CBcalgranulin B-1.8PDGFplatelet-derived growth factor-1.2CTGFconnective tissue growth factor-1.8FNfibronectin-3.0Collagen Itype I collagen-2.6Collagen IItype II collagen-2.32.3 芯片结果的半定量RT-PCR验证从Genbank检索表1和表2中列出的20条基因序列，设计引物进行半定量RT-PCR检测。检测结果表明，待测基因上调或下调趋势与芯片结果吻合，如图2。ABCRP TNF-IL-1IL-6 BMP-2VEGFbFGFCbfa1MMP3HIF1b-actinControl AS分别标注bp大小1、 图片横纵座标标目请用中文标注完整，注意添加量符号和单位；2、 图片中数据的标注方式是“±s”的形式么？3、 图C、D修改同此。CDHBD IGF-1sTNFRIL-Ra CBPDGFCTGFFNcollagen Icollagen IIb-actinControl ASA：AS组织中表达上调的基因；B：上调基因的灰度扫描统计；C：AS组织中表达下调的基因；D：下调基因的灰度扫描统计图2 差异表达基因的半定量RT-PCR检测题目缺乏自明性，必须兼备实验对象、实验条件、时相点、结果效应等基本因素，采用定语+主语或主语+谓语的语法形式，请重拟3 讨论本研究采用的表达谱芯片涵盖信息量丰富的人基因组转录本信息，可以对差异表达基因进行高通量筛选。由于基因表达的个体差异，单个样本杂交的结果假阳性率较高，不利于对芯片结果进行科学判断。本研究采用3个不同的活动期AS标本，最后选取在3个样本中均有明显差异表达的基因进行RT-PCR验证以进一步排除假阳性，结果可靠，因此对后续研究有较大参考价值。AS组织中表达上调的91条已知基因中，我们认为与AS相关的主要有3类：炎症免疫相关、关节骨化相关及代谢相关的基因。我们检测到多个炎症因子如TNF-、IL-1、IL-6等的高表达，这与标本组织特性一致：实验组样本取自活动期AS患者，属高炎性免疫活性组织，必然有多种炎症因子的高表达。TNF-是重要的早期炎症因子，可诱导其它炎症因子如IL-1、IL-6的表达，激活多种炎性反应。Brown等3报道在AS患者骶髂关节检测到TNF- 表达明显上调。目前临床上采用拮抗TNF-策略开展AS治疗，可显著降低患者CRP、MMP3、VEGF水平，缓解患者的炎性疼痛。IL-1、IL-6也是重要的炎症因子，与类风湿关节炎、AS等疾病密切相关8。芯片结果还显示AS组织中VEGF、BMP-2、bFGF、Cbfa1等成骨基因的高表达。VEGF可特异性促进血管内皮细胞增生和血管生成，而骨化初期必伴有血管生成，本室已报道VEGF有明显成骨作用9。BMP-2是唯一可单独诱导成骨的因子，具有强大的成骨作用10。bFGF具有促进成骨细胞增殖作用，同时也是与骨化密切相关的毛细血管增殖刺激因子11。Cbfal是成骨分化的关键转录因子，具有明确的成骨效应12。由于AS发病的最终结果为中轴关节的骨性融合，我们认为可导致中轴关节骨化的上述成骨基因与AS发病密切相关。AS组织表达下调的78条已知基因，我们认为AS相关基因有4类：炎症因子拮抗剂、软骨组成蛋白、软骨生长因子及代谢相关的基因。sTNFR和IL-Ra分别是TNF和IL-1的拮抗剂，可以中和炎症因子对椎间、椎旁组织的刺激和破坏作用13。CB、FN、I/ II型胶原均为软骨细胞和基质的重要组成蛋白，其低表达导致软骨细胞、基质的形态难以维持，同时AS组织中MMP3的高表达（表1）也能促使软骨基质降解14，上述基因的表达变化可能参与了椎间软骨骨化过程。芯片结果还显示IGF-1、PDGF、CTGF等3个生长因子表达显著降低。IGF-1和CTGF均具有促进软骨细胞增殖、调节其分泌胶原和蛋白多糖的作用15，PDGF则具有促进软骨细胞分裂增殖、脱钙形成软骨作用16。3个与软骨细胞增殖发育相关的生长因子的低表达可能也与AS发病中椎间软骨骨化和脊柱融合有关。芯片结果还显示AS组织中氧代谢相关基因的表达发生变化：血氧蛋白HBD基因表达下调和低氧诱导因子HIF1基因表达上调。我们认为HBD表达下调导致AS组织中氧分压较低，而AS组织的低氧状态诱导了低氧诱导因子HIF1的高表达。Cramer等17报道生长板软骨细胞在低氧条件下激活HIF1表达，从而诱导VEGF的表达，抑制HIF1表达可完全阻止低氧诱导的软骨细胞表达VEGF。HIF1是VEGF在低氧条件下表达的重要条件，因此我们认为HIF1及HBD在AS发病过程中发挥重要作用。总之，本研究应用基因表达谱芯片获得了AS基因表达谱，筛选到237条差异表达基因，显示AS组织中大量基因的表达发生变化，表明可能有多个基因参与了AS发病过程。对差异表达基因特别是未知基因进行深入探讨，将有助于从分子水平理解AS的病理生理过程，为最终解析AS的发病机制提供依据。参考文献：4、1、 参考文献陈旧，注意太过陈旧的参考文献不宜引用。引用近35年的文献在80%以上，请更换或删减；2、 修改后的参考文献不能少于15篇；3、 请尽量查阅引用本刊2008、2009年的文献；4、 部分文献缺漏期号，作者姓名录入有误； 5、 请按照文献后边提示的正规格式核实补充文献。 1 Kim T H，Uhm W S，Inman R D. 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