脂质体制备方法(共8页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上微脂體(又称脂质体)及其制备方法一二微脂體(又称脂质体)    微脂體起源於1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含鹽分的水溶液後，再加以搖晃，會使脂質形成具有通透性的小球；1968年，Sessa 和Weissmann 等人正式將此小球狀的物體命名為微脂體（liposome）並做出明確的定義: 指出微脂體是由一到數層脂質雙層膜 (lipid bilayer) 所組成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂體由脂雙層膜包裹水溶液形成，由於構造的特性，可同時作為厭水性（hydrophobic）及親水性（hydrophilic）藥品的載體，厭水性藥品可以嵌入脂雙層中，而親水性藥品則可包覆在微脂體內的水溶液層中。如同細胞膜，微脂體的脂質膜為脂雙層構造，由同時具有親水性端及厭水性端的脂質所構成，脂雙層由厭水性端相對向內而親水性端面向水溶液構成，組成中的兩性物質以磷酸脂質最為常見。微脂體的形成是兩性物質在水溶液中，依照熱力學原理，趨向最穩定的排列方式而自動形成。微脂體的性質深受組成脂質影響，脂質在水溶液的電性，決定微脂體是中性或帶有負電荷、正電荷。此外，磷酸脂碳鏈部分的長短，不飽和鍵數目，會決定微脂體的臨界溫度 (transition temperature, Tc)，影響膜的緊密度。一般來說，碳鏈長度越長臨界溫度越高，雙鍵數越多則臨界溫度越低，常見的DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的臨界溫度分別是42與56，而 Egg PC(egg phosphatidylcholine)與POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的 Tc 則低於0。臨界溫度影響微脂體包裹及結合藥物的緊密度，當外界溫度高於Tc時，對膜有通透性的藥物，較容易通過膜；此外，當外界溫度處於臨界溫度時，微脂體脂質雙層膜中的脂質，會因為流動性不一致而使微脂體表面產生裂縫，造成內部藥物的釋出。在磷脂質內加入膽固醇，會對微脂體性質產生下列影響：增加微脂體在血液中的安定性，較不易發生破裂；減少水溶性分子對微脂體脂膜的通透性；增加微脂體的安定性，使其在血液循環中存在的時間較長。    微脂體可依脂雙層的層數或是粒子大小，加以命名或分類：    (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多層脂雙層之微脂體，粒子大小介於 100-1000 nm，特色是粒子內具多層脂質膜，一般而言，乾燥後的脂質薄膜，直接水合後，即形成 MLV，體積通常較為龐大，脂質含量較高。MLV 的脂雙層數，一般在五層以上；小於五層的 MLV 又稱為 oligo-lamellar liposomes 或 paucilamellar vesicle。   (2) Large Unilamellar Vesicle ( LUV) 則是單層脂雙層所構成的微脂體，一般指1000 nm 等級 (250-2500 nm 或更大)的微脂體，動物細胞便是一種 LUV。   (3) Intermediate-sized Unilamellar Vesicle (IUV) 也是單層脂雙層所構成的微脂體，一般指100 nm 等級 (25-250 nm)的微脂體。不過，目前一般文獻已經很少使用 IUV，而是將它併入 SUV 中。   (4) Small Unilamellar Vesicle (SUV）是單層脂雙層所構成的小微脂體，早期的分類指特定磷酸脂所能夠成的最小微脂體(一般以超音波震盪製成)。如egg PC 以生理食鹽水 (normal saline) 水合的 SUV 是 15 nm； DPPC 則是 25 nm。   製備微脂體最傳統的方法是薄膜搖振法。如今已經發展出非常多種製備微脂體的方法，包括：   1.) 薄膜搖振法（Thin film method; Hand-shaking method）：又稱做Banghams method，將脂質以有機溶劑如氯仿（chloroform）、甲醇（methanol）及乙醇（ethanol）等溶解，均勻混合後，利用旋轉真空乾燥機 (rotary evaporator) 使圓底瓶內的溶劑揮發之後，即可在瓶壁上形成均勻的脂質膜，在臨界溫度以上的溫度條件下，將欲包覆物質的水溶液和脂質膜混合，用手左右搖動，將瓶壁上的脂質膜振下來，脂質在水溶液中即會自動形成MLV。   2.) 冷凍-再解凍 (freez-thaw)、均質(homogenization)及超音波震盪法（sonication method）：利用微脂體破裂後會再自行密合的特性，以機械性的力量均質或超音波震盪的方式，或者多次冷凍、再解凍的方式，造成微脂體的破裂及重組再密合，最後可形成大小較均勻的單層微脂體。   3.) 反相蒸發法（Reverse phase evaporation method）：以有機溶劑溶解高濃度的脂質，快速混入對於脂質量而言體積極少的藥品水溶液，將兩者混合均勻後再以旋轉真空乾燥機使有機溶劑揮發，形成包覆率較高的微脂體。這種方法適合用來包覆較為稀少或是較珍貴的藥品及蛋白質。   4.) 有機溶劑注射法 (solvent injection)和清潔劑透析法 (detergent dialysis)：利用有機溶劑和清潔劑溶解脂質，與準備包覆的水溶液混合形成微脂體後，以透析法除去有機溶劑和清潔劑。   5.) 濾膜擠出法（Extrusion ）：可將上述方法製成的微脂體，改變成所需粒徑大小的單層微脂體。MLV或LUV置於擠壓器(extruder)中，加熱到臨界溫度以上的溫度，以氮氣或氬氣加壓，即能將粒徑較大的微脂體擠成接近濾膜孔徑大小的微脂體。重複擠壓數次後，即可製造出所需粒徑大小且粒徑分佈範圍相當窄的微脂體。利用這種方法製成的微脂體可將粒徑大小控制到一百奈米以下。   微脂粒在體內之舉止，依其本身的型態、粒徑、脂質組成、表面電荷及服用者的生理狀況、投藥部位等而有很大差異。微脂粒於靜脈注射後，在血液中至少與兩類血漿蛋白發生作用，1）所謂調理素（opsonins)可附著於微脂粒表面，促使其被RES之吞食細胞噬食。2）高密度脂蛋白（HDL）襲擊微脂粒，藉phosphatidylcholine transferase活性蛋白之助，抽掉微脂粒上之磷脂分子，使微脂粒破洞或崩潰，內容物漏出。此二作用皆導致微脂粒在體內之半減期縮短。目前已研究出幾種改善之道以延長微脂粒在血液循環中之半減期，此種微脂粒稱為長命微脂粒（stealth liposomes）。微脂粒的表面可設法接上抗體或受質，在體內發揮指向功能。針對目標細胞膜上的特殊抗原或受體，將對應抗體或受質分子接在微脂粒上，可使絕大部份的微脂粒聚集至目標細胞。微脂粒與細胞作用的機制有數種：1）膜組成交換（intermembrane transfer）：即微脂粒膜的組成與細胞膜的組成中有一部份互相交換； 2）吸著（adsorption）：微脂粒附著於細胞膜；3）膜融合（fusion）：微脂粒與細胞膜融合，將包容物送進細胞內；4）吞食（phagocytosis, endocytosis）：微脂粒被細胞吞食。欲使微脂粒依期望之機制與細胞作用，則要設計微脂粒。    阳离子脂质体(cationic liposome) 介导转染核酸进入真核细胞的方法是从80 年代中期发展起来的一种最具创新性的、高效的转染(transfection) 技术。阳性脂质体(cationic liposome) ,又称阳离子脂质体、正电荷脂质体(positively charged liposome) ,是一种本身带有正电荷的脂质囊泡。它可作为荷负电物质的传递载体,特别适用于蛋白质、多肽和寡核苷酸类物质、脱氧核糖核酸(DNA) 、核糖核酸(RNA) 等,所以在基因治疗方面有独特应用 ,近年来，成为在体外研究基因功能和基因表达调控机理的重要手段。阳性脂质体介导的转染法可将外源基因导入任意种类哺乳动物的原代细胞或连续培养的细胞，在贴壁培养体系和悬浮培养体系中均能应用，并且能得到顺时表达（transient expression）和稳定表达（stable expression）的细胞株。1  阳性脂质体的组成绝大多数阳性脂质体是由一种中性磷脂和一种或多种阳性成分组成。中性磷脂和阳性成分都是具有亲水和疏水两种基团，其分子间相互间隔定向排列形成类脂双分子层。其中,中性磷脂起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性脂质的细胞渗透功能 。阳性成分是具有不同化学结构的两性分子,多为双链季铵盐型表面活性剂,为整个脂质体提供正电荷，有很强的细胞膜去稳定化作用。目前，使用最广泛的阳性成分有以N-1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、3- N-( N, N-二甲基胺乙基) 胺基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、2,3-二油酰氧-N-2(精胺羧基酰胺)乙基-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸铵(DOSPA) 、1 ,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(DOTAP)等，具有体外稳定性好，体内可被生物降解的特点，但具有一定的细胞毒性。2  阳性脂质体介导基因转染的作用机制阳性脂质体介导的基因转染过程中，阳性脂质体的重要性体现在三个方面：（1）与DNA形成脂质体-DNA复合物（2）与细胞膜的作用（3）将DNA释放到细胞中。2.1 阳性脂质体-DNA复合物（Lipoplex）的形成最初人们认为，阳性脂质体的表面带正电荷，能被核酸中带负电荷的磷酸根所吸附，这样通过阳性脂质体的介导，可以把核酸物质结合到细胞膜上。Gershon于1993年使用电镜技术,研究了复合物的形成和结构特征。他认为,阳性脂质体最初结合到DNA分子上,在核酸分子上形成成束的囊泡聚合物。当聚合达到一定程度时,DNA 诱导的脂质体膜融合和脂质体诱导的DNA断裂同时发生,断裂后的DNA分子被包封于重新形成的脂质体中。后来，Stefan Huebner等于1999年系统地阐述了复合物的结构特征及形成机理。他指出，复合物的形成与脂质体DNA的电荷比例有密切联系。复合物有三种形式：（1）由DNA包裹的单层囊泡（2）由单层囊泡组成的寡聚复合物（3）多层囊泡聚合物。并且他提出“脂质体滚动”：当一个由DNA包裹的单层囊泡被另一个“模板”囊泡吸附，随即发生断裂，沿着“模板”囊泡“滚动”，依此类推，就形成了多层囊泡聚合物，这就解释了复合物缺口形成的原因。目前，这一观点已逐渐为广大研究者所认可。2.2 细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取    最初的研究指出，最初的研究指出,对于带负电荷的核酸物质(DNA、RNA和寡核苷酸) ,主要是通过胞饮作用(endocytosis)进入靶细胞的。通过细胞内吞作用(endocytosis) ,将复合物包封于有衣小泡(coated vesicle) 内。进入细胞质后,有衣小泡形成内吞小泡(endosome),与其它细胞内囊泡融合,又将内吞物转送到溶酶体（lysome）内,实现内吞作用介导的脂质体与细胞的融合。还有一种假说是融合理论：阳性脂质体与细胞结合后,脂质体膜和细胞膜表面重合部分发生融合,将DNA释放到胞浆中。Wrobel等曾以肝癌细胞G2(Hep G2)和中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞为靶细胞,研究了脂质体与细胞的融合过程, 证明内吞作用是融合的关键。在三磷酸腺苷(ATP) 耗竭剂和高渗介质等抑制内吞作用的物质存在下,脂质体只能与细胞表面结合,不能实现内吞作用，而此时转染效率较无抑制剂的对照组相比低了许多。Leventis等发现阳离子脂质体与细胞融合活性和转染率不一致,证明融合机制不是其转运的主要渠道。所以，人们认为细胞对阳性脂质体-DNA复合物的摄取主要通过内吞作用来实现的。2.3 阳性脂质体-DNA复合物（Lipoplex）在细胞内释放DNA的机制Hopkins等指出阳离脂质体-DNA 复合物进入细胞内与溶酶体(lysome) 膜融合，主要分布于核周高度有序的管状结构中,如核内体(endosome) 中,含有阳离子脂质体DNA 复合物的核内体膜极不稳定,可以释放出复合物。Farhood等在研究中也发现溶菌酶试剂氯醛的存在会抑制DNA向细胞的传递过程,因此,认为脂质体的主要功能是使内吞小泡去稳定化,将DNA释放到细胞中。3  影响阳性脂质体介导的基因转染效率的因素3.1 阳性脂质体与DNA的电荷比例Huebner等应用冷冻蚀刻电镜技术（cryo and freeze-fracture electronic microscopy）发现，阳性脂质体与DNA的电荷比例决定了复合物的结构和大小，电荷比例有0.2的差距，其复合物的结构、大小都有很大差异。不加DNA 的情况下，脂质体是单层囊泡（unilamellar vesicles）形式存在，其直径为65nm（±18nm）。当DNA的比例较少时，复合物多以多层囊泡聚合物（multilamellar complex）形式存在，其直径较单层囊泡要大的多。当DNA的比例较高时，复合物多以DNA包被的单层囊泡（DNA-coated,and fused DNA-coated,unilamellar vesicles）结构存在，也有少量寡聚复合物（cluster of DNA-coated vesicle），其大小较多层囊泡聚合物小的多。不同类型的细胞其吸收大小各异颗粒的能力也不尽相同。根据具体情况准备适宜的脂质体-DNA复合物对于转染效率是很重要的。3.2  细胞的状态维持转染细胞的生长是重要的，但更重要的是细胞要处于健康旺盛状态。常规的细胞操作是包括分瓶的传代（passage），每次传代以1：3到1：5的比例分瓶，具体的传代间隔时间以细胞的生长周期来决定。同时转染时机的把握也很重要一般，细胞铺满瓶底5070为宜，注意在转染时培养瓶内细胞不能长满。3.3  血清  血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低, 双分子层堆积特性改变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上, 使脂质体膜的通透性增加, 最终破裂。其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白也可引起脂质体膜的不稳定。DNA -脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的, 如果部分转染要在一定百分比的血清浓度下才能完成, 但脂质体-DNA 复合物仍必须在无血清的条件下形成。若在脂质体-DNA 复合物形成过程中血清存在的话, 将会降低转染的表达活力, 这可能是由于复合物同带负电荷的血清蛋白结合, 电荷被中和的缘故, 但当脂质体-DNA 复合一旦形成, 影响就不那么明显。3.4 载体    在实施转染的过程中, 选择适合的转染载体如同选择恰当的细胞株和培养条件一样重要。载体包括质粒、通常认为的嵌合体、杂交细菌或杂交细胞, 有时也包括病毒序列。完成转染过程后, 一些基因顺序允许载体在细菌(如普通的大肠杆菌) 中复制以增殖足够量的DNA; 另外的一些序列则是在真核细胞中克隆化的转基因表达所必需的。一类载体能在真核细胞内成指数倍复制, 最终导致细胞死亡, 它们只能用于暂时性的表达; 另一类不在真核细胞内复制的载体可同时应用于暂时的和稳定的表达。使用自发性复制的质粒, 在真核细胞中允许非指数复制, 这就可能不通过整合作用而得到稳定的表达。3.5  阳性脂质体的阳性成分    许多研究表明,阳性脂质体的阳性成分对于基因的转染率有很大影响。Claire等 以几种不同的阳性脂质体介导质粒DNA pSV-CAT 转染3T3 脂肪细胞,以氯霉素乙酰基转移酶(CAT) 活性代表转染率,结果表明转染率依次为:LipofectAMINE > DOGS > DOTAP >Lipofectin。Cheng 等 以阳性脂质体-DNA-转铁蛋白介导-半乳糖苷酶基因转染人宫颈癌上皮细胞(Hela) ,转染相对有效性为DC-Chol > LipofectAMINE。由Pinnaduwage 等合成的DTAB , TTAB ,CTAB 介导的基因转染率低于Lipofectin。4.  阳性脂质体介导转染法的优点及应用前景    阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体,具有下列优点: 可防止核酸被体内物质降解,可将其特异性传递到靶细胞中。无毒、无免疫原性,具有生物惰性,可生物降解。易于制备,使用方便,可将大的DNA 片断转运到细胞中。基因转染率高,离体细胞可以瞬间表达外源基因。目前，阳性脂质体介导转染技术在基因治疗方面取得巨大的成果，随着转染机制的阐明，这一全新的技术在今后的基因治疗领域中将发挥其无穷的潜力。制作方法一二：(1)Lipids and lipid vesiclesEgg-phosphatidyl-choline (egg-PC), dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), dimyristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC) and cholesterol (Chol) were obtained from Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) and stored in chloroform. All lipids were used without further purification. High graded mica was purchased from Ted Pella, Inc. (Redding, CA). Pure water was obtained with a MilliQ system (Millipore, Beford, MA). One of methods for preparing supported bilayers is by fusion of vesicles. Large unilamellar vesicles (LUV) were prepared by the freeze-thaw extrusion method. The lipids, dissolved in choloform, were dried to a thin film under a stream of nitrogen, and were dried overnight in vacuum for the solvent to completely evaporate. The lipid film was then hydrated and mixed by vortex. After six freeze-thaw cycles the suspension was passed through the lores of a polycarbonated membrane (200nm, Avanti Polar Lipids Inc.) with the aid of a lipid extruder (Avanti Polar Lipids Inc.). Vesicle solutions were made in aqueous solution and then diluted to the desired concentration in a 10mM MgCl2 solution. (2)ILS MethodAnother method for preparing supported bilayers in the experiment is by depositing two monolayers onto mica substrate. The first monolayer is deposited by inverse-LS method 6. Mica, which have a hydrophilic surface, was submerged just below the subphase surface before the monolayer was spread. Monolayer was then spread and compressed to the desired surface pressure. The subphase was aspirated out of the trough to slowly lower the subphase level. Eventually the subphase level reached the mica's edge, causing the first monolayer with same domain patterns as on subphase deposited on mica. With the first monolayer on mica, the surface was then hydrophobic. LS method, which required a hydrophobic surface, was used to deposit the second monolayer on mica. The final bilayer are composited by two monolayers with its' own domain patterns, which are not necessarily totally coincided. The mica was wetted all the time during deposition. After depositing the second monolayer, the mica was still immersed under subphase, a Teflon receiver was used to hold the mica with water, and flipped above subphase in order to prevent rearrangement on bilayers. 专心-专注-专业