高效液相色谱法精华总结(共17页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上高效液相色谱法的发展在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。高效液相色谱的类型广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表8-1列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。液相色谱仪流程图现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。图8-1是具有基本配置的液相色谱仪的流程图。液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。输液泵 高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。1. 对输液泵的基本要求流量准确可调。对于一般的分析工作而言，流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10粒径）的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。2. 输液泵输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能总结于表8-2。(1) 活塞型往复泵活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。单活塞往复泵： 如图8-2所示，在活塞柱的一端有一偏心轮，偏心轮连在电动机上，电动机带动偏心轮转动时，活塞柱则随之左右移动。在活塞的另一端有上下两个单向阀，各有1-2个蓝宝石或陶瓷球，由其起阀门的作用。下面的单向阀与流动相连通，为活塞的溶液入口；上面的单向阀与色谱柱相连，为活塞的溶液出口。活塞柱与活塞缸壁之间是由耐腐蚀材料制造的活塞垫，以防漏液。活塞向外移动时，出口单向阀关闭，入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。活塞向里移动时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压出活塞缸，流向色谱柱。这种单纯往复式单活塞泵构造简单、价格便宜。活塞的移动距离是可变的，流量由活塞的移动距离所决定。因为偏心轮一般每分钟转50-60次，也就是流动相的抽入和吐出以每分钟50-60次的频率周期性变化，所以，产生的脉冲很显著。减缓脉冲的办法就是在泵出口与色谱柱入口之间安装一个脉冲阻尼器。脉冲阻尼器的种类很多，但其共同特征是具有一定的容积和弹性。最常见和最简单的脉冲阻尼器是将内径0.2-0.5mm的不锈钢管绕成弹簧状，利用其绕性来阻滞压力和流量的波动，起到一定的缓冲作用。为了减小谱带展宽，也为了便于清洗和更换流动相，阻尼器的体积应尽可能小。演示动画双活塞往复泵： 如图8-3(a)所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如图8-3(b)所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。 双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。其优点是不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。(2) 隔膜型往复泵隔膜型往复泵也是一种恒流泵，其结构如图8-4所示。一块隔膜将泵缸分为两部分，一部分充满了油，另一部分充满了流动相。活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生"吸引"或"推压"，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。通过调节泵活塞的冲程即可进行流量调节。隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。隔膜泵的缺点是结构比较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。脱气装置1. 为什么要脱气流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。2. 脱气方法目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。图8-5是单流路真空脱气装置的原理图。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。梯度洗脱装置1. 为什么要进行梯度洗脱？在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。2. 梯度洗脱操作在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。线性梯度 阶梯梯度高压梯度 低压梯度 线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。高压梯度： 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的，其装置结构如图8-6所示。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置，图8-7是四元梯度系统的结构示意图。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。进样器进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色谱中所介绍的相同。色谱柱1. 色谱柱的构成色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料： 经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。色谱柱管： 内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的,其结构如图8-8所示。2. 色谱柱的填充干法填充： 在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。湿法填充： 又称淤浆填充法，使用专门的填充装置（图8-9）。3. 填料的结构色谱填料是由基质和功能层两部分构成。基质： 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层： 是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。填料的物理结构： 分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型，如图8-11所示。数据处理系统与自动控制单元数据处理系统： 又称色谱工作站。它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。一些配置了积分仪或记录仪的老型号液相色谱仪在很多实验室还在使用，但近年新购置的色谱仪，一般都带有数据处理系统，使用起来非常方便。自动控制单元： 将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制，从而使整个分析过程全自动化。也有的色谱仪没有设计专门的控制单元，而是每个单元分别通过控制部件与计算机相连，通过计算机分别控制仪器的各部分。液相色谱分离模式吸附色谱（adsorption chromatography）原理： 基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。活性硅胶： 一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布分为表面多孔和全多孔两类。硅胶既是吸附色谱最常用的固定相，也是分配色谱、离子色谱等色谱固定相的常用基质。流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。分离过程： 硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点。流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各组分被洗脱的时间（保留时间）也就不同，使得各组分相互分离。应用： 吸附色谱在早期的HPLC中应用得最多，现在，很多以前用吸附色谱分离的物质被更方便和更有效的化学键合相反相分配色谱所代替。由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。分配色谱（partition chromatography）原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。键合固定相： 分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法，因此也称液-液分配色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC，早期的液相色谱中曾广泛采用这种体系。对于一些在非极性疏水固定相中强烈保留的有机分子常常采用正相HPLC模式。反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。凝胶色谱（gel chromatography）原理： 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附、分配和离子交换等），因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱，不能被分离。比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长（图8-12）。固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相： 在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。离子色谱法（ion chromatography, IC）1. 离子交换色谱法（ion exchange chromatography, IEC）2. 离子排斥色谱法（ICE）3. 离子对色谱（ion-pair chromatography, IPC）1. 离子交换色谱法（ion exchange chromatography, IEC）IEC使用的是低交换容量的离子交换剂，这种交换剂的表面有离子交换基团。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。图8-13是阴离子交换过程的示意图。由于静电场相互作用，样品阴离子以及淋洗剂阴离子（也称淋洗离子）都与固定相中带正电荷的交换基团作用，样品离子不断地进入固定相，又不断地被淋洗离子交换而进入流动相，在两相中达到动态平衡，不同的样品阴离子与交换基的作用力大小不同，电荷密度大的离子与交换基的作用力大，在树脂中的保留时间就长，于是不同的离子相互分离。2. 离子排斥色谱法（ICE）因为离子排斥色谱的英文也可写作ion chromatography exclusion，所以用ICE作为其缩写便可与离子交换色谱的缩写IEC相区别。ICE的分离机理是以树脂的Donnan排斥为基础的分配过程。分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换树脂，分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离子交换树脂。下面以阴离子分离为例（如图8-14）说明离子排斥色谱的原理。强电解质Cl-形成H+Cl-，因受排斥作用不能穿过半透膜进入树脂的微孔，迅速通过色谱柱而无保留。而弱电解质CH3COOH可以穿过半透膜进入树脂微孔。电解质的离解度越小，受排斥作用也越小，因而在树脂中的保留也就越大。3. 离子对色谱（ion-pair chromatography, IPC）无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中性有机化合物分离的反相（或正相）色谱。然而，直接采用正相或反相色谱又存在困难，因为大多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。在反相色谱的非极性（或弱极性）固定相中的保留又太小。在这种情况下，就可采用离子对色谱。离子对色谱也称离子相互作用色谱，是在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即"离子对试剂"，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以离子对色谱也常称反相离子对色谱。液相色谱检测技术检测器： 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。几种主要检测器的基本特性列于表8-3。紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）： 以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器（图8-15）。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。多数情况下采用直接紫外检测。间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。在离子色谱中使用较多，如以具有紫外吸收的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分离的流动相，当无紫外吸收的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸收减小。柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分（过渡金属离子、氨基酸等），可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。示差折光检测器（differential refractometers, RI）原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。示差折光检测法也称折射指数检测法。绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。RI 检测器根据其设计原理可分为反射型（根据Fresnel定律）、折射型（根据Snell定律）和干涉型三种类型。荧光检测器（fluorescence detector）原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。结构： 如图8-16。特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。电导检测器（conductivity detector, CD）原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。电导池的结构： 检测体积可达到微升甚至纳升级。其基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。图8-17是一种简单结构的电导池。电导检测器工作原理： 电导池工作时，电极间及电极附近溶液中所发生的电化学过程可以用图8-18表示。当向电导池的两个电极施加电压时，溶液中的阴离子向阳极移动，阳离子向阴极移动。在电解质溶液中的离子数目和离子的移动速率决定溶液的电阻大小，离子的迁移率或单位电场中离子的速率取决于离子的电荷及其大小、介质类型、溶液温度和离子浓度。离子的迁移速率取决于施加电压的大小。所施加的电压既可以是直流电压，也可以是正弦波或方波电压。当施加的有效电位确定后，即可测量出电路中的电流值，即能测出电导值。蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector, ELSD） ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成（图8-19）。色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。其它色谱方法除气相色谱和液相色谱之外,还有以电场、激光或超临界流体为驱动力(或流动相)的色谱，简介如下。超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography, SFC） 超临界流体：指高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气体，也不是液体，但它兼具气体的低粘度和液体的高密度以及介于气体和液体之间的较高扩散系数等特征。SFC：以超临界流体作流动相，以固体吸附剂（如硅胶）或键合在载体（或毛细管壁）上的有机高分子聚合物作固定相的色谱方法。常用流动相：超临界状态下的、氧化亚氮、乙烷、三氟甲烷等。最常用，因为它的临界温度低（31）、临界压力适中（7.29MPa）、无毒、便宜，但其缺点是极性太低，对一些极性化合物的溶解能力较差，所以，通常要用另一台输液泵往流动相中添加1-5的甲醇等极性有机改性剂。色谱柱：液相色谱的填充柱和气相色谱的毛细管柱都可以使用，但由于超临界流体的强溶解能力，所使用的毛细管填充柱的固定相必须交联。应用：从理论上讲，SFC既可以象液相色谱一样分析高沸点和难挥发样品，也可象气相色谱一样分析挥发性成分。不过，超临界流体色谱更重要的应用是用来作分离和制备，即超临界流体萃取。毛细管电泳和毛细管电色谱 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）：以高压电场为驱动力，以电解质为电泳介质，以毛细管为分离通道，样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。它有多种分离模式，可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质，也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质，CE的高分离效率、高检测灵敏度，样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC）：以电渗流（或电渗流结合高压输液泵）为流动相驱动力的微柱色谱法。CEC是液相色谱与毛细管电泳相结合的产物，它的分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，一般而言，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。所用色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱。CEC还处在发展阶段，目前主要应用在药物、手性化合物和多环芳烃的分离分析。另外CEC与质谱联用既可解决LC/MS的分离效率不高的问题，又可克服CE/MS中质量流量太小的缺陷。亲和色谱（affinity chromatography）定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得。 生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。分离过程：亲和色谱是吸附色谱的发展，在分离过程中涉及疏水相互作用、静电力、范德华力和立体相互作用。在键合了某类配体的亲和色谱柱上加入含生物活性大分子的样品，只有那些与该柱中配位体表现出明显亲和性的生物大分子才会被吸附，这些被吸附的生物分子只有在改变流动相（缓冲溶液）的组成时才会被洗脱。应用：亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。HPLC在不同领域的主要应用 HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术，HPLC在部分领域的主要分析对象物质列于表8-4。液相色谱分离模式的选择分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照图8-20。专心-专注-专业