20章基因工程.pptx

基因工程基因工程InsertionCrossingover转导转导Transduction:Transduction: 由病毒介导的由病毒介导的DNADNA由一个细胞向另一个细由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后胞转移的现象。随后DNADNA会整合到受体细会整合到受体细胞的基因组中。胞的基因组中。 识别识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制同构成细菌防御机制限制修饰体系（限制外源限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA） Hin d 流感噬血杆菌种属流感噬血杆菌种属 d 株株 第三种内切酶第三种内切酶限制性核酸内切酶命名：限制性核酸内切酶命名： 属名、种名、株名属名、种名、株名限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）切割切割DNA后有后有粘端与平端粘端与平端之分或产生之分或产生平末端平末端识别位点常为识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结个碱基对、具有回文结构的构的DNA片段片段 AATGAATTCGTACCG TTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶5-NGAATTCN-33-NCTTAAGN-55-NG AATTCN-33-NCTTAA GN-5粘末端粘末端(Cohensive end or sticky end）5突出端突出端EcoR15-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-55-NCAG CTGN-33-NGTC GACN-5平末端平末端Pvu 2（blunt end）错位切割错位切割垂直切割垂直切割基因工程其他常用的工具酶基因工程其他常用的工具酶酶的种类酶的种类功功 能能DNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间羟基末端之间形成磷酸二酯键，使形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶 I合成双链合成双链cDNA的第二条键的第二条键缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端反转录酶反转录酶以以RNA为模板合成为模板合成cDNA第一链第一链多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶 在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基团切除末端磷酸基团碱性磷酸酶碱性磷酸酶Taq DNA聚合酶聚合酶 PCR扩增扩增 载体（载体（vectorvector）是由在细胞中）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使一种遗传成分，通过实验手段可使其它片段其它片段( (外源基因外源基因) )连接在它连接在它的上面，进行扩增或表达。的上面，进行扩增或表达。（一）（一） 质粒（质粒（plasmidplasmid）载体）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNADNA，一般大小约，一般大小约10106 610108 8D D，可自身复制和表，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒载体。质粒（质粒（plasmidplasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA 分子。大小约为分子。大小约为 数千碱基对。常数千碱基对。常 有有1 31 3个抗药个抗药 性基因，以利于性基因，以利于 筛选。筛选。质粒载体质粒载体1. 1. 克隆的质粒载体克隆的质粒载体2.2. 允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存。主插入，储存。主要是要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。2.2.基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体3.3. 允许外源允许外源DNADNA的插入、储存和表的插入、储存和表达。达。LOCSC重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体 1 1、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体； 2 2、pUCpUC质粒载体；质粒载体；以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。（4363bp）oripBR322pBR322的结构来源的结构来源 一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体，系列的质粒载体，包括以下四个部分：包括以下四个部分： 1 1、来自、来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）；）； 2 2、氨苄青霉素抗性基因（、氨苄青霉素抗性基因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。来的核酸内切限制酶的但识别位点。 3 3、大肠杆菌、大肠杆菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的启动子）的启动子及编码及编码-肽链的肽链的DNADNA序列，此结构称之为序列，此结构称之为lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位点（克隆位点（MCSMCS）区段。但它并不破坏该基因）区段。但它并不破坏该基因的功能。的功能。AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多克隆位点）多克隆位点）Lac promoterlacZMCS (Multiple cloning sites,多克隆位点）：多克隆位点）：指人工合指人工合成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。序列。乳糖操纵子结构与调控模式图穿梭质粒载体（ shuttle plasmid vector ） 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。早期发现的大肠杆菌早期发现的大肠杆菌- -枯草杆菌穿梭枯草杆菌穿梭质粒载体质粒载体大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌大肠杆菌- -牛乳头瘤病毒牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌迄今还没有发展出适用的大肠杆菌- -植物细胞穿梭载体。植物细胞穿梭载体。噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体噬菌体基因组长基因组长48.5 kb基因组可为线状和基因组可为线状和环状两种形式环状两种形式 (cos ends) 溶菌阶段溶菌阶段 溶源阶段溶源阶段5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 剪切 连接 (包装过程) (侵染细菌细胞后) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos ends环状环状 线状线状 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNA DNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构体外包装体外包装 噬菌体噬菌体DNADNA体外重组后，一般必须经过体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNADNA导入导入E.coliE.coli细胞内。这是因为以细胞内。这是因为以感染感染方式方式导入细胞的频率可达导入细胞的频率可达10106 610108 8/gDNA/gDNA， 噬菌体的噬菌体的包装限制包装限制为野生噬菌体为野生噬菌体DNADNA（约（约48.5 kb48.5 kb）的）的75%105%75%105%。 由于由于噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%105%左右的，要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb) phage12bp插入式载体：插入式载体： cI cI基因插入失活基因插入失活：如：如 gt10 gt10等载体，在等载体，在cI cI基因上有基因上有EcoEcoR IR I及及HinHind IIId III的酶切位点。外源基因插入后将导致的酶切位点。外源基因插入后将导致cI cI基因的基因的失活。失活。cI cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活基因插入失活：如：如charon16Acharon16A载体，在非必须区段载体，在非必须区段引入引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoEcoR IR I位点，插入失活后位点，插入失活后利用利用X-galX-gal法筛选（兰白筛选）。法筛选（兰白筛选）。 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A 替换型载体（取代型载体）l 外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必需的片段感染和复制非必需的片段 ( (约约20 kb)20 kb)l 这些载体是用这些载体是用Lac 5Lac 5（乳糖操纵子的大部分（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的系列，包括完整的Lac ZLac Z）替换入噬菌体的）替换入噬菌体的中间区段，同时将中间区段，同时将Lac 5Lac 5作为选择标记，使作为选择标记，使用时用用时用EcoEcoRR水解，去掉中间的片段，再水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染后，感染E.coliE.coli使之在使之在E.coliE.coli内繁殖，并内繁殖，并裂解裂解E.coliE.coli，形成空斑。，形成空斑。如如 EMBL系列系列Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNADNA的步骤的步骤1. 应用适当的核酸内切酶消化载体， 除去可取代的DNA片段； 2. 将上述所得的 DNA载体臂同外源 DNA片段的连接； 3. 对重组体的DNA分子进行包装和增 殖，以得到有感染性的重组噬菌体（左右臂连接） （三段自身连接） （插入片段） 根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选（黏性质粒）柯斯质粒载体（黏性质粒）柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体cosmidcosmid载体载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive site）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb单链DNA噬菌体载体 (M13)M13M13噬菌体载体噬菌体载体 M13M13是一种含单链（是一种含单链（+ +）DNADNA（ssDNAssDNA）的）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段，这类载体主要用来获得大量的单链片段，这种单链片段在遗传学研究中主要用来这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（测定序列（sangersanger双脱氧法）、基因的双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链定点突变研究、异源双链DNADNA的分析等。的分析等。 RF DNAM13M13载体载体 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。Blue-white selection M13M13克克隆载体隆载体分子结分子结构图构图噬菌粒载体噬菌粒载体T7T3用于体外转录（三）其他载体（三）其他载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YACyeast artificial chromosome, YAC） 细菌人工染色体细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC）动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）关病毒、逆转录病毒） 人基因组十分庞大，约含3109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体。正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：* 四膜虫端粒（四膜虫端粒（tel)* 酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（ARS)* 酵母着丝点酵母着丝点 (CEN)* 酵母的选择标记酵母的选择标记 (TRP1、URA1)YAC载体载体 质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。载体的种类和特征载体的种类和特征四种常用载体的比较* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的表达载体：表达载体： 按特殊设计构建的，按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。蛋白质的克隆载体。 核糖体结合位点核糖体结合位点启动子启动子转录终止子转录终止子复制复制起点起点 噬菌体的阻遏物操作系统噬菌体的阻遏物操作系统 真核表达载体的构建有：真核表达载体的构建有：u原核生物的序列，来自质粒的复制原核生物的序列，来自质粒的复制起始序列、抗生素抗性标记基因。起始序列、抗生素抗性标记基因。u真核生物表达调控的元件，包括启真核生物表达调控的元件，包括启动子，增强子、转录终止和动子，增强子、转录终止和polyApolyA加尾加尾信号。信号。u真核细胞的复制起始序列，可筛选真核细胞的复制起始序列，可筛选标记基因等。标记基因等。 主要包括质粒载体和病毒载体，使主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒用的调控表达元件最初多来源于病毒SV40SV40病毒载体病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体腺相关病毒载体1. 用用PCR技术获取基因技术获取基因2. 用用RT-PCR（逆转录（逆转录-PCR）获得基因）获得基因3. 从基因组文库或从基因组文库或cDNA文库中获取基因文库中获取基因4人工合成基因人工合成基因是根据是根据DNA半保留复制和半保留复制和DNA聚合酶的特性建立聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增起来的体外复制扩增DNA片段的技术片段的技术1.用用PCR技术获取基因技术获取基因（聚合酶链式反应聚合酶链式反应, , polymerase chain reaction）Kary B.Mulis 1985年发明年发明,获获1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖可将微量的目的可将微量的目的DNA在体外扩增在体外扩增100万倍以上万倍以上PCR技术技术模板为模板为mRNA需逆转录酶需逆转录酶产物为产物为cDNART-PCR与与PCR区别区别基因文库基因文库gene library基因组文库的构建基因组文库的构建机械法或限制性机械法或限制性内切酶切割内切酶切割cDNA文库的构建文库的构建基因文库构建示意图基因文库构建示意图 已知目的基因的碱基序列可用已知目的基因的碱基序列可用DNA合成仪合成仪合成基因片段，然后用其他反应将基因片段合成基因片段，然后用其他反应将基因片段连接起来连接起来优点优点可修饰基因可修饰基因 可在基因两端设计接头可在基因两端设计接头可选择各种宿主生物偏爱的密码子可选择各种宿主生物偏爱的密码子1. 根据克隆片段的大小。根据克隆片段的大小。2. 根据实验目的（表达或扩增）根据实验目的（表达或扩增）等等等等4. 4. 加人工接头连接加人工接头连接 人工接头（人工接头（linkerlinker，接头），接头）是指人是指人工合成的，连接目的基因两端的含有某些限工合成的，连接目的基因两端的含有某些限制酶位点的寡核苷酸片段，如含制酶位点的寡核苷酸片段，如含EcoREcoR的的linkerlinker与目的基因的连接图（与目的基因的连接图（p371p371）。）。5. 5. 聚合酶链反应特异引物连接聚合酶链反应特异引物连接 利用利用PCRPCR技术，将技术，将PCRPCR引物的引物的55端端加上限制性内切酶的切点。加上限制性内切酶的切点。载体载体PucPuc系列（系列（PUC18/19PUC18/19）带有带有E.coli DNAE.coli DNA的短区段，含：的短区段，含： (1) Lacz(N) (1) Lacz(N)即编码即编码半糖苷酸半糖苷酸N N端的端的 146 146个个AAAA信息也称信息也称多肽；多肽； (2) (2)编码区插入一个编码区插入一个MCSMCS并不破坏阅读框，使少数几个并不破坏阅读框，使少数几个AAAA插入插入到到 该酶的该酶的 N N端而不影响其功能；端而不影响其功能； (3)Plac (3)Plac可以启动可以启动LaczLacz的的 转录，表达，但受阻转录，表达，但受阻pr.pr.阻遏，阻遏，IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代半乳糖苷）能够去阻遏。半乳糖苷）能够去阻遏。JM103JM103受体菌含受体菌含lacz(c)lacz(c)可以编码可以编码半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 C C端部分端部分互补互补 当载体转入当载体转入JM103 lacz(n)与与lacz(c) lacz(c) 互补，编码互补，编码具有活性酶具有活性酶prpr使底物使底物X-galX-gal生色（生色（5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷产半乳糖苷产生兰菌落）。生兰菌落）。当当MCSMCS插入外源插入外源genegene片断时，几乎无一例外产生无片断时，几乎无一例外产生无互补能力互补能力的的 氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM 103外源基因片段插入外源基因片段插入 白菌落白菌落IPTGlacz(c) X-gal蓝菌落蓝菌落-半乳糖苷酶半乳糖苷酶图图 -互补互补EcoRIPBR325-APOAIPUC19-APOAI加样孔加样孔2.7kb5.4kb0.89kb图图 pUC19-APCAI和和pBR325-APOAI质粒质粒DNA及其及其EcoRI酶切酶切产物的琼脂糖电泳图产物的琼脂糖电泳图PUC19一、原核生物表达体系（二）、提高外源基因表达水平的策略pBV220 、pET等等, 多种载体有商品化供应多种载体有商品化供应原核细胞原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子聚合酶可以识别的启动子原核细胞转录终止子原核细胞转录终止子原核细胞核糖体结合位点原核细胞核糖体结合位点 其他调控序列其他调控序列结构特点结构特点克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列: : 表达质粒表达质粒载体载体pET的结构的结构 适用于结构复杂的大分子蛋白，尤其那些空间结构和生物学活性依赖于糖基化或磷酸化等修饰的蛋白质。 常用的真核表达体系有酵母，昆虫和哺乳类动物细胞等。二、真核生物表达体系 主要包括质粒载体和病毒载体，使主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒。用的调控表达元件最初多来源于病毒。SV40SV40病毒载体病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体腺相关病毒载体优点优点l重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性。重复性。l可表达需要翻译后修饰的蛋白。可表达需要翻译后修饰的蛋白。l可表达基因组可表达基因组DNA，也可表达，也可表达cDNA。l可表达分泌性蛋白。可表达分泌性蛋白。l蛋白产物对宿主细胞的影响不大，且自身也蛋白产物对宿主细胞的影响不大，且自身也很少降解。很少降解。l表达系统相对复杂表达系统相对复杂l成本高成本高l生长周期长生长周期长演讲完毕，谢谢观看！