萘胺法测定植物根系活力及过氧化物酶活性的测定(共5页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上a-萘胺法测定植物根系活力及过氧化物酶活性的测定顾莎莎 顾亚东 薛烨 摘要：植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和代谢水平即根系活力直接影响植物地上部分的生长和营养状况以及产量，是植物生长的重要生理指标之一。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。关键词：根系活力；a-萘胺；过氧化物酶；愈创木酚 植物根系能氧化a-萘胺，生成红色的a-羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，使这部分根染成红色。根对a-萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切联系。日本人相见、松中等认为a-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活性越强，对a-萘胺的氧化力也越强，染色也越深。a-萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮燃料，其在pH7.0时在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值,从而利用此反应来间接测定溶液中a-萘胺的量。 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶活性。 材料与方法1.1 实验材料野菱须根系，a-萘胺溶液，0.1mol/L磷酸缓冲液，1对氨基苯磺酸溶液，亚硝酸盐溶液，野菱的叶，愈创木酚，30过氧化氢，100mmol/L磷酸缓冲液pH6.0，反应混合液1.2 实验方法1.2.1 a-萘胺法测定植物根系活力取50ug/ml a-萘胺和磷酸缓冲液各25ml，于三角烧瓶中混匀，须根系洗净、吸干，取12克，浸入瓶中，同样取a-萘胺和磷酸缓冲液各25ml于另一三角瓶，不放根系作对照，5min后两瓶各取2ml，按步骤作第一次测定。将两瓶置于25恒温箱保存60min后，各取2ml，按步骤作第二次测定。取2ml培养液加入10ml水混匀，再顺次加入1ml对氨基苯磺酸溶液和1ml亚硝酸钠溶液，混匀并定容至25ml，室温下放置25分钟，于510nm测OD值。作标准曲线：以50ug/ml a-萘胺为母液，配制40、30、20、10、5、0 ug/ml溶液各10ml，取2ml按步骤分别反应，测OD值，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线。1.2.2 过氧化物酶活性的测定称取植物材料0.5克，剪碎，放入研钵中，加适量磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000rpm低温离心15min，取上清液，贮于低温下备用。取两只比色杯，一只中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为对照，另一只加入反应混合液和上述酶液1ml，立即开启秒表记录时间，于470nm处测OD值，每10秒钟读数一次。结果计算：以每分钟OD变化值（A470/gFW·min）表示酶活性大小。也可用每min OD值变化0.01作为1个过氧化氢酶活性单位（以U表示）。 U/gFW·min = A470×VT/W×Vs×0.01×t VT-提取酶液总体积（mL） W-植物鲜重(g) Vs-测定时取用酶液体积(mL) t-反应时间(min)2. 结果与分析2.1 a-萘胺法测定植物根系活力 标准曲线浓度（ug/ml）0510203040100.0940.2130.4310.5950.825200.0550.1800.3990.5330.719300.1020.2160.4090.6000.783综合考查后选择第三组数据，因为其作图后各点基本在一条直线上，其它两组有一定误差，可能由量取液体时的不慎操作、仪器的操作及仪器本身的不稳定性所致。作图如下：实验中测得OD值数据见下表：组别对照组实验组第一次测定0.5900.511第二次测定0.4980.426结果：反应相同时间后，产物OD值实验组较对照组低 a-萘胺浓度实验组较对照组低结果分析：实验组中根系受重金属离子胁迫，呼吸作用等生理活动增强，过氧化物酶的活性增加，氧化 a萘胺的能力增大，产物OD值减小，且溶液中残留的 a萘胺减少，即 a萘胺浓度小。反应时间愈长，产物OD值和a- 萘胺浓度都增加，可能是由于随着时间的增加，过氧化物酶活性减小，氧化 a萘胺的能力减弱，产物OD值增加，溶液中残留的 a萘胺增加，即 a萘胺浓度增加。误差分析：对照组中无根系，OD值和a萘胺浓度都应不变，可能由于操作不当或比色皿清洗不净等原因造成两次结果不同。2.2 过氧化物酶活性的测定数据：时间/s102030405060OD值0.1050.1200.1360.1570.1890.220过氧化物酶活性：1020 = 15 2030 = 16 3040 = 21 4050 = 32 5060 = 31结果分析：随时间增加过氧化物酶氧化愈创木酚的产物的OD值也随之增加，过氧化物酶活性也逐渐增强。由于叶片的呼吸作用，光合作用等生理活动不稳定，因此过氧化物酶对其氧化程度也不同，导致过氧化酶活性随时间变化而变化。开始时酶活性逐渐增强，到一定时间后活性又开始下降。误差分析：前两组数据读数过早，反应还没有稳定，数值较接近，最后的两组数据可能由于计时上有一定误差，读数偏晚，导致结果偏大。希望能有可以自动计时读数并记录数据的设备。3. 结果重金属离子胁迫会对植物的根系活力和植物体内氧化物酶的活性有影响，可使根的活很降低，使过氧化物酶的活性降低，从而影响植物的呼吸作用和光合作用等生理活动，以致影响植物的生长发育。专心-专注-专业