微生物检验技术知识点(共105页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上1微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。2 微生物的种类：原核细胞型：细菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体； 真核细胞型：酵母菌、霉菌、微藻类等； 非细胞型：病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）。3 病源微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物，称之为病原微生物。4、微生物对产品的污染：对产品造成污染的微生物来源：土壤、空气、水、人和动植物、生产原料、生产器械及包装材料等5 微生物检验的意义：1）是衡量动植物性产品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检产品能否食用的科学依据之一。2）通过微生物检验，可以判断产品加工环境及产品卫生环境，能够对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。3）微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。6 微生物检验的范围与对象： 微生物检验<>范围1.生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。2.各种产品的原、辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。3.各类产品加工、储藏、销售诸环节的检验：包括食品从业人员的卫生状况检验、加工工具、运输车辆、包装材料的检验等。4.产品的检验：重要的是对出厂产品、可疑产品及食物中有毒食品的检验.微生物检验<>对象 7类(1)食品 (2)化妆品 (3)药品 (4)一次性用品及其他生活用品(5)应施检疫的出口动物产品 (6)环境 (7)有关国际条约或其他法律、法规规定的强制性卫生检验的进出口商品我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项大肠菌群是指示水质受粪便污染的指示菌，细菌总数指示水体受污染物污染的情况。微生物检验常规技术包括显微技术，染色技术，灭菌和消毒技术，培养基制备技术，接种，分离纯化和培养技术，无菌取样技术，微生物的计数技术，菌种保藏技术，微生物常规鉴定技术等平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。菌落形成单位cfu，colony-forming unit 。疏水网膜法(HGMF)：采用疏水网膜过滤样品，将捕获了被检微生物的疏水网膜上倾入适当的琼脂，经一定时间培养后即可计数直接荧光过滤膜技术(DEFT)：将样品经特殊滤膜过滤后，经吖啶橙染色，利用紫外线显微镜来快速测定活菌数。葡萄糖苷酶荧光法：通过在培养基中加入指示剂、色素、荧光物质，成为快速检验大肠菌群的常用方法。第二章 第一节 微生物检验的基本程序1 检验前的准备 2样品的采集 3样品的送检 4样品的处理方法5 致病菌检验参考菌群的选择 6样品的检验 7检验结果的报告检验前的准备1. 准备好所需的各种仪器：如冰箱、恒温培养箱、显微镜等2. 按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3. 准备好实验所需的各种试剂、药品，制备好普通营养琼脂或其他选择性培养基。根据需要分装试管或灭菌后倾注平板或保存在46 的水浴中或保存在4 的冰箱中备用。4. 做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌3060min。5. 检验人员的工作衣、鞋、帽、口罩等灭菌后备用。6. 工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。微生物实验室检验 <>流 程 无菌取样样品均质样液稀释样品接种恒温培养结果观察食品微生物检测常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、酵母总数、霉菌总数，此类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不能超标。致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中之重。食品微生物检验<>指标 我国卫生部颁布的食品微生物<>指标有菌落总数,大肠菌群和致病菌三项。1.菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。2.大肠菌群：大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。3.致病菌：致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行检验。4.霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。5.其它指标：还应包括病毒：肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒、猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标。样品的采集目的：便于食品卫生质量监督管理; 鉴别食品中是否存在有毒有害物质;为新产品、新资源利用、新食品、新化工产品、新工艺在投产前进行卫生鉴定。采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。样品采集的种类1. 大样，指一整批；2. 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；3. 小样，又称检样，做分析用的，一般为25g采样的步骤：采样前调查现场观察确定采样方案采样 样品封存 开具采样证明采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。检验样品：食品生产环境如水、空气、土壤样品; 生产各工序样品如设备、管道;各类食品 发生食物中毒时的样品微生物检验的取样方案1 ICMSF取样方案； 2 美国FDA的取样方案；3世界粮农组织（FAO）取样方案；4 我国的食品取样方案。ICMSF取样方案国际食品微生物规范委员会(简称ICMSF)的取样方案是依据事先给食品进行的危害程度划分来确定的。将所有食品分成3种危害度:I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品;类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变; 类危害：食用前经加热处理,危害减小的食品。将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重3档。根据以上危害度的分类，又将取样方案分成二级法和三级法。二级法：设定取样数n,指标值m,超过指标值m的样品数为C,只要C>0,就判定整批产品不合格。三级法：设定取样数n,指标值m,附加指标值M,介于m与M之间的样品数C。只要有一个样品值超过M或C规定的数就判整批产品不合格。美国FDA的取样方案食品药品管理局(FDA)的取样方案与ICMSF的取样方案基本一致，所不同的是严重指标所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就是说所取的样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成一个375g样品，混匀后再取25g作为试样检验，剩余样品妥善保存备用。食品微生物检验采样方法:按照上述采样方案,能采取最小包装的样品就采取完整包装,必须拆包装取样的应按无菌操作进行。不同类型的食品应采用不同的工具和方法:1.液体样品：充分混匀,以无菌操作开启包装,用100mL无菌注射器抽取,注入无菌容器。2半固体样品：以无菌操作拆开包装,用无菌勺子从几个部位挖取样品,放入无菌容器。3.固体食品：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取,割取时应兼顾表面与深部,注意样品的代表性; 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品,放入无菌容器。 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。 4.冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取;大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻块上举取样品,也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品,放入容器。 固体食品和冷冻食品的取样还应注意检验目的,若需检验食品污染情况,可取表层样品;若需检验其品质情况,应取深部样品。5.生产工序监测(1)车间用水。自来水样从车间各水龙头上采取冷却水;汤料等从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。(2)车间台面、用具及加工人员手的卫生监测。用5cm2孔无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采表面干燥,则用无菌稀释液润湿棉签后擦拭;若表面有水,则用干棉签擦拭,擦拭后立即将棉签头用无菌剪刀剪入盛样容器。(3)车间空气采样。直接降尘法。将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部,打开平皿盖5min,然后盖盖送检。样品的送检要求 1、采集好的样品应及时送到食品微生物检验室：要快速运送，不要超过3小时；易变质的样品要冷藏，若路途遥远，无需冷冻样品可保持在15低温下运送；需保持冷冻状态的样品，可保存在泡沫塑料隔热箱，维持0。2、样品送检时：必须认真填写送检申请单，以供检验人员参考。3、送检过程：要注意防污染、防散漏、防变质。4、检验人员接到送检单后 应立即登记,填写序号,并按检验要求,立即将样品放入冰箱或冰盒中,并积极准备条件进行检验。5、食品微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品 一般阳性样品发出报告后3d(特殊情况可适当延长)方能处理样品;进口食品的阳性样品,需保存6个月方能处理;阴性样品可及时处理。样品的预处理方法(一) 液体样品的处理1瓶装液体样品的处理用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用无菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用无菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1. 捣碎均质法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。是对大部分食品样品都适用的办法。2剪碎振摇法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3研磨法：将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4整粒振摇法：完整自然保护膜的颗粒状样品(如蒜瓣、青豆等)直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的无菌稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。5胃蠕动均质法：这是国外使用的一种新型的均质样品的方法。将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中,开机均质。均质器有一个长方形金属盒,其旁安有金属叶板,可打击均质袋,金属叶板由一恒速马达带动,作前后移动而撞碎样品（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18h，或在45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。菌落总数：因微生物的生活特性各异，不可能在一种培养条件下全部生长，故检出的菌落数小于细菌总数，但仍可评定食品的污染程度，是常用方法。菌落总数的食品卫生学意义：作为食品被污染程度的指标，反映食品的新鲜程度；预测食品的存放期限程度：食品生产过程中变质与否、食品生产过程中食品的一般卫生状况。大肠菌群食品中大肠菌群的数量测定：一般采用100克或100毫升食品中的大肠菌群最可能数（MPN）来表示。国标测定方法：乳糖九管发酵法。 不仅表明样品中有无粪便污染，另方面还可根据数量的多少，判定样品受污染的程度致病菌检验参考菌群的选择蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、蜡样芽胞杆菌畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌样品的检验过程（一）、收样： 1、收到样品后逐一核对验收，登记编号。 如2004年收到的50号样品，编号可写成：2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。（二）、检验1、选择检验方法国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准； 每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等2、检验要求（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。（4）微生物检验不进行复检4检验结果的报告1. 经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份 。2. 将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。3. 收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。4. 在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。 第二节 微生物检验的常用仪器 显微镜 移液器、冰箱 超净工作台、灭菌锅 离心机 水浴锅、培养箱 烘箱或干燥箱 匀质器 各种玻璃器材 （一） 普通显微镜的保养：1、观察完后，移去观察的载玻片标本。2、用过油浸镜，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3、转动“物镜转换器”，放在低倍镜的位置。4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套（二）培养箱普通恒温培养箱 隔水式恒温培养箱 电热恒温培养箱生化恒温培养箱 二氧化碳培养箱培养箱的配置和使用：配置：22（）、30（）、37（）培养箱各一个使用注意事项：(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。(2)内放一杯水，以保持湿度。(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。(5)不得当烘箱使用。（三）水浴锅：水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位（四）匀质器：无菌均质器 高速匀浆机（五）超净工作台：侧流式、直流式和外流式超净台的使用和注意事项：1使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间4060分钟；2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；3、请保持超净台整洁，不要堆积杂物；4、使用完毕，勿忘关闭酒精灯；5、请做好使用记录。6、如遇故障，除记录在册外，还应及时与有关人员联系，尽早排除故障。7、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。（六）离心机 ：普通离心机 高速离心机 超速离心机转子：许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。1水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。2角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。3垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。（七）灭菌器 ：干热灭菌器 湿热灭菌器1、电烘箱（干燥箱）用途： 用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。 玻璃器皿等物的灭菌，温度160165，灭菌 2小时。玻璃器材的干热灭菌方法：(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160165保持2小时即可。 (5)待自然降温冷却后(60以下)才能开门取出玻璃器皿。 2、高压灭菌锅用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。种类：手提式、立式、卧式杀菌锅3 滤菌器（八）普通冰箱冰柜1、 取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；2、 关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好;3、冰柜内的不要样品应及时清理二、常用玻璃仪器及用具（一）量器类1、移液管1ml，2ml，5ml，10ml，25ml2、容量瓶50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml3、量筒  容量（ml）10、25、50、10、25、500、1000、20004、微量移液器（二）其他常用玻璃器皿1、培养皿3.5cm,7cm，9cm，15cm 2、试管各种试管的使用：13mm×100mm ：生化反应及凝集反应 15mm×150mm ：斜面培养 18mm×180mm：检样稀释3、三角瓶 50mL，150mL，200mL， 250mL，500mL，1L，2L，3L4、烧杯 容量（mL）：25、50、100、150、250、500、1000、2000、3000、5000三、玻璃器皿的清洗和灭菌(一)新购的玻璃器皿1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。2、再浸泡于的盐酸中数小时，最后用流水冲净(二)用过的玻璃器皿 1、含油脂器材的清洗：（1）单独高压灭菌； （2）趁热倒去污物；（3）倒放在铺有吸水纸的篮子上，置100 烘箱中烤0.5h;（4）再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。2、含菌试管的清洗高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。3、含菌平皿的灭菌（1）底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；（2）趁热倒去污物；（3）肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。4、含菌吸管的清洗（1）把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；（2）用肥皂水洗涤一次；（3）最后用清水冲洗干净即可。5、载玻片及盖玻片的清洗（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5 %的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；（2）盖片用软布擦干即可；（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用95%的酒精浸泡片刻，晾干备用。（三）玻璃器材的灭菌（1）清洗后烘干；（2）加塞包扎；（3）灭菌: 干热灭菌:160 165烘箱中烤2h 湿热灭菌:121 20min第三章 细菌生化试验和血清学试验第一节 细菌常见的生化反应试验（一）什么是生化试验?Ø 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。Ø 生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应（二）生化试验的方法：1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（三）生化试验的注意事项1. 待检菌应是新鲜培养物，培养1824h。2. 待检菌应是纯种培养物。3. 遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4. 应做必要的对照试验。5. 提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。（四） 检验细菌的生化试验范围:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验二、糖醇类代谢试验（糖醇类发酵试验葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 V-P试验甲基红（Methyl Red）试验 MR七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验（一） 糖醇类发酵试验1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解12种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。常用的糖醇Ø 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖Ø 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖Ø 三糖：棉子糖Ø 多糖：菊糖、肝糖、淀粉Ø 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2试验方法： 用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0 培养13天，每天观察结果。3、结果观察和记录： 产酸产气，阳性，以“”表示 产酸不产气，阳性，以“+”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示应用：沙门氏菌可发酵葡萄糖但不发酵乳糖。大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。有些菌可发酵同一种糖类，其发酵产生的代谢产物也不尽相同。如大肠埃希菌和志贺菌均可发酵葡萄糖，但前者产酸产气，而后者仅产酸，故可利用此试验来鉴定细菌。（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。2、方法：取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。应用：可用于鉴别肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型或产碱型）。也可用于鉴定葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。3、结果观察与记录（三） V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的O2氧化为二乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与培养基中的蛋白胨中精氨酸等所含的胍基生成红色化合物，即V-P试验阳性，称VP（+）反应。应用：本试验常与甲基红试验一起使用。二者结果通常相反。即如大肠埃氏菌、沙门菌、志贺菌等甲基红呈阳性反应，而VP反应则为阴性。沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应为阳性，而甲基红反应为阴性。2、试验方法（1）奥梅拉（OMeara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法（）奥梅拉法Ø 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 培养48h， 每1mL培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。（2）贝立脱法Ø 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1 培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。（3）快速法Ø 将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录Ø （1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P +Ø （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -（四）甲基红试验（MR）1、原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；（2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。应用：主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。 肠杆菌中许多细菌甲基红试验为阳性，如沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，但肠杆菌属和克雷伯菌属为阴性。（五） 七叶苷水解试验、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1 培养24h,观察结果。3、结果观察与记录Ø （1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 +Ø （2）培养基不变色者，为阴性，记录为 -（六） 甘油品红试验1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。2、试验方法:取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。3、结果观察与记录Ø （1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+Ø （2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一） 靛基质（吲哚）试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。2、试验方法所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂或（2）欧-波试剂Ø 将待检菌小量接种于培养基中，于36±1 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。Ø 或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。3、结果观察与记录：Ø 呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+Ø 无红色者，为阴性反应，记-（二） 硫化氢（H2S）试验1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1培养2448h，观察结果。3、结果观察与记录Ø 培养基底部呈黑色，为阳性，记+Ø 培养基底部无黑色，为阴性，记-应用：用于肠道杆菌鉴定试验，如：沙门氏菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属及变形杆菌等为阳性；肠道杆菌中其他菌属为阴性，沙门菌属中的甲型副伤寒沙门菌也为阴性。（三） 尿素酶试验1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌尿素酶阳性，雷氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。2、试验方法：挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。3、结果观察与记录：Ø 培养基变呈粉红色，为阳性，记 +Ø 培养基颜色不变，为阴性，记 -（四） 氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录：Ø 试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 +Ø 试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。阳性反应试验管颜色变化过程：紫色黄色紫色原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。应用：沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试剂均为阳性。志贺菌除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均阳性。故可作为肠杆菌科细菌鉴定的重要方法。此外，对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。3、结果观察与记录Ø 试验管立即出现绿色，为阳性，记 +Ø 无色为阴性，记 -。Ø 应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。（六） 明胶液化试验1、原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。2、试验方法：Ø 挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于36±1。Ø 另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。3、结果观察与记录：明胶液化，为阳性，+。明胶凝固，为阴性，-。四、 有机酸盐和铵盐的利用试验碳源利用试验：细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验（一） 枸橼酸盐利用试验1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。2、试验方法：挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1 培养14天，每天观察结果。3、结果观察与记录：Ø 斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；Ø 无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-应用：枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别，在肠杆菌科中，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属等为阴性，其他菌属为阳性。（二） 丙二酸盐利用试验1.原理：某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于36±1 培养48h，观察结果。3、结果观察与记录：Ø 培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+Ø 培养基无颜色变化,为阴性,记-应用：常用于肠杆菌科细菌鉴定，亚利桑那和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性反应，其他各属均为阴性。Mimic试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。 I - 吲哚（indol）试验 M - 甲基红（methyl red）试验Vi - VP（Voges-Proskauer）试验 C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验I M Vi C试验 大肠埃希菌 + + - - 产气杆菌 - - + + 五、 呼吸酶类试验（一） 氧化酶试验1.原理： 氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂：1% -萘酚-乙醇液 1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法：用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂12滴在培养物上,再加入1% -萘酚-乙醇液12滴, 在30秒内判定试验结果。3、结果观察与记录：Ø 在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +Ø 不变色或为红色者,为阴性,记 -应用：奈瑟菌属的菌种均呈阳性反应。也用于区别假单胞菌与肠杆菌，肠杆菌科细菌为阴性，假单胞菌为阳性。莫拉菌属也为阳性。Ø 本试验中避免接触含铁物质，否则易出现假阳性，选铜绿假单胞菌为阳性对照，大肠埃希菌为阴性对照。（二） 过氧化氢酶（触酶）试验1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2、试验方法：挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上