氨基酸的薄层层析实验报告(共9页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上生物化学实验报告姓 名： XXXXX 学 号： XXXXXXXXXXXXXX 专业年级： XXXXXXXXXXXXXXX 组 别： 第X实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期XXXX-XX-XX实验地点第X实验室合作者XXXX指导老师XXX评分 教师签名 批改日期 一、实验目的1、掌握薄层层析法的实验原理。2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）的方法。二、实验原理1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板（如玻璃板、塑料片、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25毫米左右）后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析：吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（SiOH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.硅胶吸附薄层层析的特点： 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。硅醇基显较弱的酸性，因此，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。硅胶的活化温度通常为105110，不能过高。2、氨基酸与茚三酮的显色反应： 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3、混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率Rf值（rate of flow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。即：=由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。三、材料与方法：（一）、材料：分析样品（氨基酸混合液）、吸附剂（硅胶）、粘合剂（0.5%的羧甲基纤维素钠）、氨基酸的异丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）；（二）、器材：层析板（5cm×15cm）、尺子、铅笔、小烧杯、玻棒、量筒（10ml）、吹风机、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱；（三）、方法：制版点样层析显色处理与结果分析1、实验流程：2、操作步骤：调浆：称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。（1）薄层板的制备：涂布：取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。活化：70烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。 标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距约1cm。（2）点样：取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。 点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样（轻触疾起）。加样后原点扩散直径不超过2mm。 （将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。3）层析： 当展层剂前沿离薄层板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界限。（用热风吹干或在90下烘干30分钟，即可显出各层斑点。4）显色：四、结果与讨论： （一）结果：1、实验数据：样品各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及溶剂前缘至样品原点中心距离记录丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3各氨基酸色斑中心至原点中心的距离a（cm）3.402.781.751.752.853.49溶剂前缘至样品原点中心距离b（cm）6.676.676.676.676.676.67根据Rf=计算，得：样品Rf值推断的氨基酸名称丙氨酸0.510-甘氨酸0.417-精氨酸0.262-混合点10.262精氨酸混合点20.427甘氨酸混合点30.523丙氨酸2、 现象：（1）点样时，点扩散后大小适中，不超2mm。（2）层析时，浸入展层-显色液时层析板放得比较正，在层析约40min后溶剂前缘到超过达层析板的1/2处，取出并烘干。溶剂前沿是一条较平整的水平线。（3）在利用烤箱烘干后，层析板上出现6个的紫红色斑点，混合点2显色较浅。（4）第一次制备薄层板时，涂板非常不均匀；第二次制备的薄层板薄厚较为均匀。（二）结果讨论：1、结果上的误差问题：在实验的结果中，我们可以发现混合点2的Rf=0.4270.417（测定的标准值），混合点3的Rf=0.5230.510（测定的标准值）。原因可能有：（1）在整个实验过程中，层析板的制作是基础，硅胶分布的均匀与否直接影响了实际的实验。而从溶剂前沿并不完全水平可以知道，实验所用的层析板质量不是很好，一定程度上影响了实验的数据测定，导致实验的误差。（2）人为误差的存在，在判定斑点前沿和测量距离时，存在一定的误差，导致了结果上的不一致性，但这类影响较小。2、结果反思：学习制作层析板的技巧，多做多练，在练好基础技能的前提下，可以提高实验的准确率和成功率。3、结论：薄层层析法操作较为简单，在实验的结果上也比较的精确，能有效地分离出样品各组分。运用在本实验，效果也较好。根据计算所得的数据，可见混合点1的Rf（0.262）值等于精氨酸的Rf值（0.262），混合点2的Rf值（0.427）接近于甘氨酸的Rf值（0.417），混合点3的Rf值（0.523）接近于丙氨酸的Rf值（0.510）。又由实验原理可得，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。所以每一种氨基酸所对应的Rf值应是唯一的。所以我们可以得出如下结论：在一定误差允许的范围内，混合点1所对应的氨基酸为精氨酸，混合点2所对应的氨基酸为甘氨酸，混合点3所对应的氨基酸为丙氨酸。最终可以得到结果：混合的氨基酸溶液中，存在有丙氨酸、甘氨酸和精氨酸三种氨基酸。专心-专注-专业