实验室中文版原位杂交(共9页).doc
精选优质文档-倾情为你奉上In situ hybridization final edition第一部分：1 固定（第一天，下午）1) 用DEPC水配制8%多聚甲醛（粉末）（作为储备液，4C可保存1月）：2) 多聚甲醛（粉末）8g，溶解于100ml DEPC水中，60C孵育30min（此时多聚甲醛不溶）；加入10N NaOH 15ul，调节pH值于7.4左右，用手振荡，多聚甲醛将快速溶解；3) 用8%多聚甲醛储备液和PBS缓冲液配制4%多聚甲醛：8%多聚甲醛储备液50ml、10×PBS（DEPC配制）10ml、DEPC水40ml（4%的多聚甲醛作为工作液在1周内使用）；4) 将组织块放置于10×体积的4%多聚甲醛溶液中固定1-2h（室温），其间缓慢摇动，4C放置过夜（16h，其间缓慢摇动）。注意：固定时，一定要保证多聚甲醛和材料中水分的充分交换，否则会造成材料不能很好固定！2 脱水（第二天，早晨）：按下列顺序对材料进行脱水：1× PBS (DEPC) 5min 2次70%乙醇(DEPC) 5min 80%乙醇(DEPC) 5min90%乙醇(DEPC) 5min100%乙醇 5min (脱水时间应随组织的体积大小适当变化)100% 乙醇 -30C过夜！注意：脱水时间的长度长一点不会对材料造成太大影响，但若脱水时间不够，用二甲苯透明的时候会让二甲苯浑浊，不能进行很好的置换，直接影响包埋效果！3包埋（包埋的时间依据材料的大小而定）：将材料转移到100%乙醇中，室温放置 15min；再次在100%乙醇中放置 10-15min；100%乙醇/二甲苯 30min二甲苯浸泡 30min×2次；注意：二甲苯浸泡时间不确定，依据为材料透明即可。如若透明时间过长，会使材料过脆，包埋好的材料在切片时会破碎！二甲苯/石蜡 30min石蜡 30min 石蜡 40min根据常规包埋方法进行包埋。注意：包埋过程中，二甲苯一定要脱干净，否则也会使材料变脆！因此在III蜡中放置的时间可以酌情延长，依据材料的体积而定。Note：组织过大，二甲苯未能使材料内的部分透明，切片时，此处材料会脱落，造成空洞。可否考虑100%乙醇/二甲苯浸泡时间稍微延长！？4 组织切片：注意：切片材料为全鱼或者去除内脏的幼鱼片段时，骨骼（尤其是脊柱）会损伤切片刀片，造成切片脆裂或者切痕，在展片时，材料会破裂。因此，在切片时，一旦发现材料破碎或者出现刀痕，必须将切片刀片横移，避开刀片缺口！切片厚度应为5-8um；应同时准备一些该材料的组织切片用于HE染色；组织切片时为避免RNase污染，应保持使用无粉手套和DEPC水，切片完全干燥后应保存于4C。贴片，展片：所用已经coating的玻片一般只使用远离书写端1/3处。一来可以节约随后步骤中使用试剂的量；二来节约切片材料；三便于封片。展片时，先用滴管将DEPC水在靠近1/3处涂抹很薄一层液体，将弯钩解剖针挑取单张材料切片（尽可能切割整齐）放于液面（此时，材料将浮于液面，注意不要将切面朝上！），用滤纸将远端多余水分吸去一部分（以免过度展片），放置3-5行（视材料宽度而定），于39-42C的展片机上展片。Slide cleaning：5% Decon 90清洗1h，自来水冲洗2h，蒸馏水冲洗数次并在200C干燥8h，并用手套将玻片放置于玻片盒中，保存于4C。Poly-L-Lysine coating:用10mM Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）配制50ug/ml 多聚赖氨酸溶液，并向无RNase的玻片上滴加多聚赖氨酸溶液，37 干燥24 h。第二部分 探针制备:1) 将目的基因的cDNA或ORF插入到pGEM-T Easy载体（Promega，或者其他带有T7和SP6 RNA聚合酶结合位点的载体），提取质粒DNA，并测序验证；2) 测序验证后，挑选含所需插入方向的质粒，用T7和SP6结合位点外围的前后引物扩增包含T7和SP6结合位点和目的片段的线性DNA；3) PCR产物的纯化和定量；4) 0.5-1ug PCR产物用于T7和SP6的体外转录（制备探针）：T7的转录效率比SP6高，一般用T7合成反义链，而SP6合成正义链探针；如果可能，直接将欲作为合成探针的模板克隆入pGEM-T载体中，然后通过PCR合成转录模板。克隆入普通亚克隆载体（如：pMD-19T）中，然后 用T7-M13和SP6-M13-引物成模板后，转录的效果不是太好！0.5-1ug PCR product? ml10X DIG RNA labeling mix2 ml10X Transcription buffer2 mlT7 or SP6 polymerase (20U/ml)2 ml（共40U）RNase inhibitor (40U/ml)1ml（共40U）DEPC DW? ml总体积20 ml5) 混合并离心;6) 37C温育2-3h；7) 加入DNase I (RNase free) (10U/ul) 2ul，混合并离心；8) 37C温育15min；9) 加入50ul 100% 乙醇 (2.5×体积), 2ul (1/10体积) NaAC；10) 涡旋混匀，在-20C 放置2-6h或者过夜；11) 4C，14000rpm离心30min；12) 用70% DEPC乙醇洗一次；13) 4C，14000rpm离心15min；14) 移去乙醇并室温放置5min使乙醇挥发；15) 加入50 ul DEPC水和1ul RNase 抑制剂； 16) 使用前测量 RNA 探针浓度（Sp6, 100ng/ul; T7, 400ng/ul）17) 探针可在-80C 保存 1月化将目的片段/ORF插入到pMD-19T载体中，挑选一定插入方向的克隆，用T7-M13和SP6-M13-引物扩增目的片段，使其带上T7和SP6的启动子序列。电泳纯后，作为RNA探针合成的模板！一张用于原位杂交的切片一般需要加入200ul左右的探针！注意：这种方法合成出的模板，是否能很好合成RNA探针，还需要深入的证明！第三部分：in situ hybridization第一天：杂交同时准备正义探针（T7）和反义探针（SP6）。1) 复水二甲苯 5min×3次（如近期再次实验，试剂可反复利用）100% 乙醇 1-5min×2次90% 乙醇 1min80% 乙醇 1min70% 乙醇 1min 0.85 X PBS-1 5min0.85 X PBS-2 5min 0.85 X PBS-3 5min2) 37C蛋白酶K 4-10ug/ml (从20mg/ml储备液稀释)处理5-15min (成鱼卵巢，15min; 幼鱼卵巢，10min；胚胎，稚鱼，精巢5min) (Tilapia幼鱼和成鱼 用蛋白酶K（10ug/ml）处理5min即可Kobayashi!)；3) 0.85X PBS洗5min；4) 4%多聚甲醛在室温中再次固定15min；5) 2mg/ml 甘氨酸(蛋白酶K的抑制剂？从甘氨酸储备液20mg/ml稀释)室温处理15min；6) 0.1M TEA (三乙醇胺) (50% TEA 2.65ml+ 2N HCL 1.05 ml +DEPC 100ml)处理5min (dilute from stock before using)室温；7) 0.25% 乙酸苷/ 0.1M三乙醇胺（用前向0.1M TEA中加入乙酸苷) 10min，(100ml 0.1M TEA+ 250ul acetic anhydride)室温；8) 2 X SSC 5min RT9) 预杂交：66%去离子甲酰胺/2 X SSC，60C孵育1h（在染缸中进行）；本实验时原位杂交一般使用液体体积为70-80ml，高度以刚好淹没材料为准。50 ml 预杂交液:去离子甲酰胺: 33ml20XSSC (DEPC) 5mlDEPC水 12ml10) 60C-65C于杂交缓冲液中杂交14-16hr (湿盒中进行，可在其中加入预杂交液，以保证杂交过程中杂交体系不会干)。然后将湿盒封闭，避免在高温下，盒内湿度下降。一张用于原位杂交的切片一般需要加入200ul左右的探针！(Save probe for re-use if the probe is OK!)Note：所有在高于室温下进行的湿盒中反应，均需将湿盒封闭！Hybridization buffer: Final concentrationto prepare 10mlFormamide60%6ml1.0M Tris-HCL (pH: 8.0)0.02M200ul0.5M EDTA (pH: 8.0)0.0025M50ul100Xdenhardts solution1X100ulNaCl（2.5M）0.3M1.2ml50% dextran sulfate7.5%1.5mlDEPC treated DWX950ulKeep the hybridization buffer at -20CPrepare the hybridization solution: Probe with final concentration 200-500ng/mltRNA (20mg/ml) 1ul/mlHybridization buffer According to the number of your slides Water bath at 80C for 10min to denature RNA probe Load the hybridization solution with probe to slides.第二天：Wash and staining (从这一步开始，溶液可以用蒸馏水进行配制，无需DEPC)Washing（rinse）：1)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min 2)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min （用20XSSC配置，切勿用2XSSC直接配置！）3)2XSSC 37C 10min 4)RNase treatment RNase/2XSSC 100g/ml (RNase A的浓度应为 10-100ug/ml) (RNase专用湿盒)5)2XSSC 60C 20min 6)0.2XSSC 60C 20min Note: Please increase the time and times of washing if the background is very high.染色:1）DIG1 洗涤 室温 5min DIG1 bufferFinal concentration for 300mlMaleic acid 0.1M 3.48g NaCL 0.15M 2.63gpH to 7.5Add D.W. to 300 mlAutoclave注意：根据罗氏说明书，未稀释抗体保存于4C，可放置至产品失效日期；稀释后的抗体，在4C仅能保存12h。切忌冻存！2）DIG2 封阻(DIG1中加入1% 封阻剂（BSA）) 30min 室温 (Chamber3)3）Anti-DIG-AP is diluted by 50010000 times in DIG2 （最好依据产品说明书稀释2000-5000倍，即使抗体的量较少，也可通过延长显色时间进行调整） 30min 室温 (Chamber3) (稀释后的抗体可重复使用!) 4）DIG1洗涤 15min×35）DIG3检测 15min DIG3 (缓冲液+底物)：Total 30ml1M Tris-Hcl pH 9.5 3ml5M NacL 0.6ml1M MgCL2 1.5mlDEPC 24.9ml（呈色緩衝液（staining buffer）100mM Tris, pH=9.550mM MgCl2100mM NaCl0.05% Tween20其餘補3次過水(3d H2O)。）To avoid the diffusion of NBT and BCIP, add 5-8% (w/v) vinyl alcohol to DIG3 and heat to 80-90 degree in water bath to completely dissolve it. Cool down and add NBT and BCIP (Always keep DIG3 with vinyl alcohol in room temperature.) NBT 150lBCIP 112.6l观察：DIG3染色30min后，镜检！如果信号足够强，用Tris-HCL-EDTA (pH 8.0)终止染色；50% 乙醇室温洗涤5min100% 乙醇脱色12min50% 乙醇室温再次洗涤5min将切片放入0.85X PBS镜检DW洗涤Mount the slides with Glycergel Mounting Medium (DakoCytomation). Otherwise if the staining and background is not so strong, just stop the staining in 1X TE buffer, then immerse in DW for more than 5 times. Then mount the slides. 专心-专注-专业
