淀粉酶活性的测定(共2页).docx

精选优质文档-倾情为你奉上(植物中)淀粉酶活性的测定一 实验目的本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。二 实验原理植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有淀粉酶及淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。淀粉酶和淀粉酶都各有其一定的特性，如淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70维持15分钟以钝化淀粉酶，便可测定淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0加以处理，钝化淀粉酶，以测出淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。三 实验材料 萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右）四 实验仪器和试剂 1仪器：电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管25mL（9个）、10mL（1个）、试管6支、移液管1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计2试剂： 1淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL混匀即是。3,5二硝基水杨酸：精确称取3,5二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。五 操作步骤1酶液的提取： 称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。2淀粉酶活性的测定： （1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。（2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5），准确加热15分钟，在此期间淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。（3）在试管中各加入1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）向对照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，摇动23分钟，静止2分钟，以钝化酶的活性，再加入1淀粉2mL。（5）将测定管置40（±0.5）恒温水浴中保温15分钟，再加入40下预热的1淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40水浴中准确保温15min取出，迅速加入4mL0.4mol/LNaOH，以终止酶的活动，然后准备下一步糖的测定。 3淀粉酶和淀粉酶总活性的测定： 取上述酶提取液1mL，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至10mL（稀释程度视酶活性的大小而定）。混合均匀后，取3支试管，1支为对照管，2支为测定管，各加入稀释的酶液1mL、pH5.6的柠檬酸缓冲液1mL。以上步骤重复淀粉酶测定的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。4麦芽糖的测定： （1）标准曲线的制作： 取25mL刻度试管5个编写号分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL，然后于各管加入蒸馏水使溶液为2mL，再各加3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（2）样品的测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1mL，分别加入25mL刻度管中，再加入1mL的水，3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，混匀置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光度，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶的活性。六 结果计算A: -淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）A1: -淀粉酶对照管中麦芽糖量（mg）B: +-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）B1: +-淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg）专心-专注-专业