《生物化学》实验指导(8个实验)(共17页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上生物化学实验指导吕杰 编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍生物化学实验指导是新疆大学资源与环境科学学院生物化学课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。目 录实验一 氨基酸纸层析 4实验二 DNS-CL法测定N末端氨基酸 5实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7实验四 酪蛋白的制备 8实验五 葡萄糖标准曲线的绘制10实验六 酵母蔗糖酶的提取及活力测定12实验七 酵母RNA的分离及组分鉴定14实验八 维生素C的定量测定16实验一 氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。  分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率 Rf值）就不同，从而达到分离的目的。三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器:  层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿 2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔 2cm 画一个“+”作为点样位置，共 5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点 5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在 2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。(3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约 1.5cm，约 5060ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：  1、何谓分配层析法和分配系数？实验二 DNS-Cl法测定N末端氨基端一、实验目的1、 学习聚酰胺薄膜层析的方法。2、 学习DNS-Cl测定氨基酸的原理及方法。二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。  分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验器材 层析缸 毛细管 紫外灯 烘箱 恒温箱 聚酰胺薄膜 吹风机2、试剂： 各种层析纯标准氨基酸 DNS-Cl丙酮溶液 （称取25mg DNS-Cl溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，至于冰箱保存，一个月内稳定） 0.2mol/L NaHCO3 溶液 NaOH 1M HCl 1M 展开剂I 88%甲酸：水=1.5:100（v/v） 展开剂II 苯：冰醋酸=9:1（v/v）四、实验步骤：1、氨基酸的DNS化分别取0.2-0.3mg的层析纯标准氨基酸及样品氨基酸溶于0.5mL 0.2mol/L的NaHCO3 溶液中，各取0.1mL于有玻璃塞的试管中，加入0.1mL DNS-CL的丙酮溶液，测pH值，必要时用NaOH 调pH至9.0-9.5，于室温放置2-4h，冷风吹除丙酮后，加HCl调pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提，分层后取有机相；2、聚酰胺薄膜的准备将聚酰胺薄膜剪成7*7cm的方块，在距边0.5cm处画互为垂直的两条基线，交叉点为原点，若只做单向层析，则只画一条基线，在基线上每隔1cm画一个点样点。3、点样用毛细管取样，点在点样点上，点样点直径应小于2mm，若多次点样，点一次吹干一次。4、展层将点好样的聚酰胺膜卷成圆筒形，点样侧在筒内，放入层析缸内，槽内加入5-10ml的展开液I进行展开，溶剂到达距顶部0.5cm时，取出膜吹干。进行双向层析，第一向层析完毕，取出完全吹干，将膜转90°，用展层液II 展开。为了区分DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-苏氨酸和DNS-丝氨酸，DNS-丙氨酸和DNS-NH2，可在展开后，吹干，接着用其它展层液在同一方向上展开。5、DNS-氨基酸的检测展层结束后，取出薄膜用吹风机吹干，在360nm或者280nm紫外灯下检测，DNS-氨基酸应呈黄色荧光，用样品的层析谱与标准的DNS-氨基酸层析谱比较可鉴定样品氨基酸的种类。五、结果分析： (1) 用铅笔将层析荧光点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：  1、为什么用棉线而不是橡皮筋固定薄膜？实验三 考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质一、实验目的1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法二、实验原理    此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）三、器材与试剂器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液枪试剂 1. 0.15M生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂  (考马斯亮蓝G250 100mg 溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85% H3PO4 ，用蒸馏水稀释至1000ml。最终试剂中含有0.01% G250，4.7% 乙醇，8.5% 磷酸)3. 0.1mg /ml蛋白质标准液  （结晶牛血清蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15M生理盐水配制成0.1mg/ml蛋白溶液。）4. 两种未知浓度的蛋白质溶液。四、实验步骤1. 标准曲线的制作(1) 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。试     剂试管编号1234560.1mg/ml标准蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.00.9%生理盐水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝溶液（ml）333333A595(2) 加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。2. 未知溶液蛋白质含量的测定(1)未知蛋白质溶液:取实验室预备的未知蛋白质溶液，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测 A595 值(2) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。(3) 如果所测定的A595值不在标准曲线内，该如何处理？3. 结果计算根据标准曲线求出样品中蛋白质的含量。五、复习思考题、作业题：1.  Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？2为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？3. 根据蛋白质的呈色反应，测定蛋白质的方法还有哪种？根据所学知识推断各种测定方法有何优点、缺点实验四 酪蛋白的制备一、实验目的1、学习从奶粉中制备酪蛋白的原理和方法。2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试剂与器具（一）材料 新鲜牛奶（一）试剂1、95%乙醇 1200mL2、无水乙醚 1 200mL3、0.2mol/L pH4.7醋酸醋酸钠缓冲液 300ml 先配A液与B液A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸醋酸钠缓冲液3000ml。4、乙醇乙醚混合液乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）（二）器具1、离心机 2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉5、烧杯 6、温度计四、操作步骤（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。（三）准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。五、注意事项1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。六、实验报告1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。2、合理分析实验所得率七、思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？实验五 葡萄糖标准曲线的绘制一、实验目的掌握葡萄糖标准曲线的绘制方法，进一步掌握分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1 主要仪器（1）玻璃试管：20mL×7（2）刻度吸管：（3）容量瓶：（4）恒温水浴锅（5）沸水浴（6）离心机（7）天平（8）分光光度计2 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g DNS和262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。四、操作步骤1 制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）O.D.540nm0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘出标准曲线。五、结果与计算：用电脑绘出的标准曲线，写出回归方程。六、注意事项1标准曲线制作时各反应管应同时进行沸水浴加热，并准确进行定容。七、思考题1如何正确绘制和使用标准曲线?实验六 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、实验目的 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。二、实验原理至今我们所发现的大多数酶都是蛋白质，因而蛋白质的分离提纯方法也适用于酶。对于不同来源的各种酶，通常采用盐析沉淀、吸附、离子交换、结晶及各种物理化学方法将它提纯，在纯化过程中，应尽量避免高温，剧烈的机械搅拌、强酸、强碱等容易造成蛋白质变性的各种激烈条件。蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。因此只要用一种适当的试剂测定反应中还原糖的含量，就可以得知它的活力。蔗糖酶在碱性环境中非常容易失活，因此可以用碱来终止酶促反应。实验中的蔗糖酶活力测定是在35下进行活力测定，每三分钟能使5%蔗糖溶液释放1毫克还原糖的酶量定为一个活力单位。还原糖的测定是利用3,5-二硝基水杨酸与葡萄糖生成红色化合物，通过比色法测定还原糖的量即为酶活力。三、实验仪器1试管，2. 量筒，3三角瓶，4滴管，玻棒，5分光光度计，温箱，冰箱，离心机，恒温水浴，水浴锅，温度计。三、试剂1、1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g DNS和262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。3、0.lmol/L醋酸缓冲液(pH4.6）：0.2mol/L醋酸溶液（11.55mL冰醋酸定容至1升），25.5mL与0.2mol/L醋酸钠溶液（16.4g NaAc或27.2g NaAc·3H2O定容至1升）24.5mL混合稀释到100mL。4、5%蔗糖溶液（W/V）：5克蔗糖以pH4.6的0.1mol/L醋酸缓冲液溶解，定容至100mL。5、5mmoL/L的磷酸钠缓冲液6、0.5mL 1mol/L 的NaOH四、操作：1.蔗糖酶粗制品的提取：取10个g干酵母，加入2.5g硼砂，少许石英砂，逐步加入5mmoL/L的磷酸钠缓冲液（适当加入），充分研磨30min，然后4000r/min离心15分钟，记录上清液总体积，为蔗糖酶的粗制品。2葡萄糖浓度测定（l）葡萄糖标准曲线制作取11支试管按下表顺序加入1mg/mL葡萄糖液，水及3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）。管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）O.D.540nm0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 上述溶液混合均匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，测540nm光密度（O.D值）。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光密度值为纵坐标做出标准曲线。（2）样液的测定取四只试管分别加入2mL稀释的酶液。1支作对照，加入0.5mL 1mol/L 的NaOH摇匀，使酶失活。另3支作测定管。此4支试管和5%蔗糖溶液放在35水浴中预热10分钟。分别吸取2mL 5%蔗糖液于上述四支试管中，并且准确计算时间，3分钟后在测定管中也加入0.5mL 1mol/L NaOH，摇匀（整个反应在35下进行）。管号稀释酶液（mL）1mol/L NaOH（mL）5%蔗糖（mL）1（对照）20.5（35之前）2220.5（3分钟后立即加入）2320.5（3分钟后立即加入）2420.5（3分钟后立即加入）2从反应混合物中吸取0.45mL溶液，用DNS试剂测定酶反应生成的还原糖数量（方法同标准曲线的制作），反应混合液中加入1.55mL的蒸馏水，再加入1.5mL的DNS。以管1作为对照，管2、3、4为测试管。管2、3、4测定的OD值进行平均，带入标准曲线的回归方程，计算出蔗糖酶在35下，以5蔗糖为底物时，3分钟能释放出的还原糖的总毫克数，此数值即为总活力单位。实验七 酵母RNA的分离与组分鉴定一、实验目的：学习稀碱法提RNA的原理与技术。二、实验原理：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90提取34h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达2.6710.0%，而DNA含量仅为0.030.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。三、器材与试剂：1器材：干酵母粉（市售）。 鲜酵母（市售）。pH试纸（pH110）。 台天平（100g）。烧杯100mL（×1）。 量筒50mL（×1）、10mL（×1）。抽滤瓶500mL（×1）、布氏漏斗10cm（×1）。吸管0.5mL（×1）、1mL（×2）、2mL（×2）、5mL（×1）。离心机5000r/min。2试剂：0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。乙酸（A·R）。 95%乙醇。无水乙醚（C·P）。 氨水（C·P）。10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10mL，缓缓 倾于水中，稀释至100mL。5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL，贮于棕色瓶中。苔黑酚三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O。临用时配制。定磷试剂17硫酸溶液：将17mL浓硫酸缓缓加入到83mL水中；2.5钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。10抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合。17硫酸溶液：2.5钼酸铵溶液：10抗坏血酸溶液：水1：1：1：2（V/V）四、操作步骤：1RNA的提取：置4g干酵母粉于100mL烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40mL，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟（4000r/min）。取上清液（30ml左右），加入95%乙醇30mL，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10mL），继用无水乙醚洗2次（每次10mL），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定(全部用离心的方法)。2鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸液5mL，加热至沸1-2分钟，将RNA水解。（1）取水解液0.5mL，加苔黑酚FeCl3试剂1mL，加热至沸1分钟，观察颜色变化。（2）水解液2mL，加氨水2mL及5%硝酸银溶液1mL，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。（3）磷酸 水解液2mL，加入定磷试剂1 mL。水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。五、结果与讨论：1所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？2RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？实验八 维生素C的定量测定一、实验目的：1学习维生素C定量测定的一般原理；2掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定法定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。二、实验原理：维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2，6-二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法等。其中广泛采用的是DCIP滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2,6-DCIP还原成无色的还原型2,6-DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的2,6-DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2,6-DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6-DCIP立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6-DCIP便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2,6-DCIP标准溶液的消耗量（mL），可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2,6-DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6-DCIP标准溶液滴定至终点。其反应式如下：本实验采用2,6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。三、器材及试剂1器材：市售果汁；吸管；容量瓶；锥形瓶；微量滴定管；天平；抽滤装置2试剂： 2%草酸溶液：草酸2g，溶于100mL蒸馏水。（2%草酸液可用4%偏磷酸醋酸溶液代替） 1%草酸溶酸：溶1g草酸于100mL蒸馏水。 标准抗坏血酸溶酸：准确称取50.0mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀至500mL。贮棕色瓶、冷藏，最好临用时配制。 1%HCl溶液。 0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液：溶250mg2，6-二氯酚靛酚于150mL含有52mgNaHCO3热水中，冷却后加水稀释至250mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4约可保存一至三周）。每次临用时稀释10倍，并以标准抗坏血酸溶液标定。四、操作步骤：1样品提取滴定（水果汁样品）将果汁充分摇匀后，取5mL样品放入50mL容量瓶中，用2%草酸溶液溶液稀释，并定容至50mL，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10mL放入锥形瓶内，立即用已标定过的2,6-DCIP溶液快速滴定至样品液呈现玫瑰色，并保持15-20s不变即为终点，记录所消耗的2,6-DCIP溶液的体积(mL)。样品液中抗坏血酸含量宜在0.1-0.2mg/mL范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另取10mL蒸馏水作空白对照滴定1份。样品液滴定3份，滴定结果取平均值。22,6-二氯酚靛酚溶液的标定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mL（含0.1mg抗坏血酸）置100mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，用滴定管以稀释10倍的2,6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少mg抗坏血酸。五、结果与讨论：1计算：抗坏血酸（mg/100g样品）=×100 T=1mL染料能氧化抗坏血酸mg数。 W=10mL样液相当于含样品之g数。VA为滴定样品时所消耗的染料mL数（平均值）；VB为滴定空白时所消耗染料的mL数。2讨论：本法测定VC的利与弊。注：2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样功效。若样品中含有大量Fe2+可用8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以还原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用4%偏磷酸-醋酸液代替2%草酸液。如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。如滤液颜色太深，滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色。样品中某些杂质亦能还原2,6-二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15秒钟为准。六、思考题1提取VC时，加入2%草或4%偏磷酸-醋酸液的作用是什么？2如果提取液颜色太深而又无法脱尽，严重影响滴定终点判断时，是否有其它办法能准确判断出终点？专心-专注-专业