阿司匹林含量测定综述(共25页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上目录专心-专注-专业阿司匹林含量测定方法综述陈明静 药学0902 摘要：阿司匹林阿司匹林（aspirin），又名乙酰水杨酸（acetulsalicylic acid），为较温和的解热镇痛药，在临床上有广泛的应用。本文综合概述了阿司匹林原料药、阿司匹林制剂在体内和体外的含量测定方法。关键词：阿司匹林；阿司匹林制剂；含量测定中国药典（2010版）中阿司匹林原料药及其制剂的含量测定采用酸、碱滴定法，而近几十年来，随着色谱技术、光谱技术、电泳技术等的飞快发展，阿司匹林的含量测定方法有了突破与发展。1 阿司匹林在体内的含量测定方法现已有的关于人血浆中阿司匹林含量测定的报道主要都是采用高效液相色谱法。它具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。26选用不同的检测器，会有不同的检测灵敏度。1.1阿司匹林原料药体内含量测定1.1.1反相高效波相色谱法（RP-HPLC）1【仪器与试药】Waters2690高效液相色谱仪，配置有996二极管阵列检测器及Millennium数据处理系统；旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；TGL16高速离心机(上海医用仪器厂)。 水杨酸、苯甲酸对照品(中国药品生物制品检定所)；磷酸为分析纯，乙睛为色谱纯；水为超纯水。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，5um)，流动相为甲酵-乙睛-0.2磷酸(18：32：50)，检测波长为237nm，流速为1.0mL/min。【溶液配制】 精密称取10.10mg水杨酸对照品，用甲酵溶解，并定容至10ml，得到1.010mg/L水杨酸的储备液，并用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液。精密称取10.44mg苯甲酸，用甲酵溶解，并定容至10mL，得到1.044mg/L苯甲酸的储备液。取lml储备液，用甲醇稀释至l0ml，得到104.4g/ml的内标工作液。【样品处理与测定】精密量取血清样品0.5nl，加入内标苯甲酸溶液(104.4g/mL)50L，乙睛2ml，旋涡振荡2min，15000rmin离心5min，取上清夜20ul，在上述色谱条件下进样，分别记录内标与样品的色谱图与峰面积。按外标法以峰面积计算，即得。【计算】外标法一点：C供、C对分别为供试品和对照品的浓度；A供和A对分别为其对应的峰面积；D为稀释倍数。1.1.2高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS/MS法）2彭翱等建立了测定人血浆中阿司匹林和水杨酸浓度的HPLCMS/MS法，该方法灵敏度高、特异性强，方法的定量下限（LOQ）为25ng/mL，可用于准确测定生物基质中阿司匹林及其代谢产物水杨酸，适用于阿司匹林的人体代谢动力学研究。【测定条件】色谱条件：色谱柱：Atlantis dC18色谱柱（4.6mm×100mm,5m） 流动相：40%含0.05%甲酸的乙腈和60% 10mmol/L甲酸（PH=3.5） 流速：1.5mL/min（分流比1：9） 柱温：40 进样量：10L，每个样品分析用时3.5min。质谱条件：采用点喷雾（ESI）离子源，在负离子模式下选用多反应监测（MRM）的质朴扫描方式进行测定，阿司匹林（ASA）、水杨酸（SA）和4-ABS（内标）的母/子离子对的质荷比分别为：178.9136.8，136.992.8，162.9118.9。【标准溶液的配制】以含氟化钠5mg/mL的人空白血浆为基质，配制浓度分别为25、50、100、250、500、1000、4000和10000ng/mL的标准溶液，以及浓度为75、750、7500ng/mL的质控样品。【血浆样品处理】将血浆样品于室温下解冻并混匀后，取200L加入1.5mL离心管中，再加入50L 1mol/L的盐酸和200L的内标物，混匀后加入600L乙酸乙酯，震荡1min，1300r/min离心5min。取上清液，氮气吹干，加入300L流动相复溶，10L进样。【计算】采用内标法，内标物为4-ABS AS、AR分别为内标物和对照品的峰面积；CS、CR分别为内标物和对照品的浓度。 AS、AX分别为内标物和供试品的峰面积；CS、CX分别为内标物和供试品的浓度；D为稀释倍数。1.2 阿司匹林制剂体内含量测定1.2.1气相色谱-质谱联用法（GC-MS）3 杨丽莉等建立了人血浆中阿司匹林和水杨酸气相色谱-质谱联用测定法，并研究了肠溶阿司匹林片在健康人体内的药代动力学。结果为阿司匹林和水杨酸的日间及日内的RSD分别小余4.78%及6.16%，平均回收率大于96.9%。阿司匹林和水杨酸的最小检测浓度分别为1.0ng/L,0.1ng/L，认为该方法灵敏度较高，测得的数据准确可靠。【方法】色谱柱HP-5 25m×0.2mm ID适应弹性毛细管柱。内标苯甲酸，血样酸化后经乙醚-二氯甲烷（4：1）提取，BSTFA衍生化进样，采用选择离子检测方式检测、定量。【标准溶液配制】分别精密称取阿司匹林及水杨酸标准品20.00mg，用乙酸乙酯溶解、定容，配成浓度为200mg/L的储备液，用时用乙酸乙酯稀成标准工作液，浓度为阿司匹林1.0g/mL，水杨酸0.10mg/mL。内标甲苯酸用乙酸乙酯精密配成10.0g/mL溶液，4冰箱保存。【色谱条件】色谱柱：HP-5弹性适应毛细管柱25m×0.2mm（ID） 温度：接口250，汽化室220，柱温100，保持1min后以15/min升至220。 载气：氮气（99.999%） 流量：0.9mL/min 选择性离子检测（SIM）：阿司匹林195m/z，水杨酸267m/z，苯甲酸179m/z。【血浆样品处理】血浆样品预处理取肝素抗凝血浆0.5mL精密加入内标溶液20.0L，3mol/L HCl 50L，用乙醚一二氯甲烷(4：1)30mL提取，振荡1min，离心(3000r/min，5min)，取上清液2.5mL 35吹干，加入BSTFA50L，35反应20min以上，进样0.5uL。【标准曲线的绘制】于空白血浆中加入阿司匹林、水杨酸标准溶液，使其浓度为2.0，10.0，20.0，50.0，100，200，400ng/mL，水杨酸0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0g/mL，按样品处理项下操作，测的阿司匹林、水杨酸于内标的峰面积比值（Y）。用计算机处理Y与其对应浓度C，求线性回归方程。【计算】采用标准曲线法 Y=a+bC a，b为常数，C阿司匹林或水杨酸的浓度，Y为阿司匹林或水杨酸与内标物的峰面积比值。1.2.2高效液相色谱法1.2.2.1高效液相色谱-荧光检测法（HPLCFLU法）周燕文等采用HPLCFLU测定人血浆中阿司匹林活性代谢物水杨酸的浓度，并研究人体内的药动学。方法为采用Zor-baxSBC18色谱柱(150mm×4.6mm，5mm)，流动相为0.02mol/L乙酸胺(冰醋酸调pH2.2)乙腈四氢呋喃(65：30：5)，流速1.0mL/min。激发波长为300nm，发射波长为405nm。结果显示水杨酸0.02882.3000g/mL线性良好(r=0.999)，最低检测浓度为28.8ng/mL.，方法回收率92.48109.98，日内、日间RSD分别为3.096.35、3.087.16。认为所建方法操作简便、快速、灵敏、准确、干扰少，适用于测定水杨酸血药浓度及阿司匹林药动学研究。4【色谱条件】色谱柱：ZorbaxSBC18（150mLn×4.6mm，5m）流动相：0.02mol/L乙酸胺（冰醋酸调pH2.2）一乙腈一四氢呋喃(65:30:5)流速：1.0mL/min柱温：室温检测波长：Ex=300nm，EM=405nm【荧光条件】激发波长：300nm 发射波长：405nm【血样的处理与测定】精密量取250L血浆，置2mL具塞塑料离心管中，加入100L10%三氯乙酸，漩涡振荡lmin后，1.3×104 r·min离心7min，取上清液20L进样。【计算】 Cx和CS分别为供试品和对照品溶液浓度，FX、FS、F0分别为供试品、对照品和空白溶液的荧光物质强度。1.2.2.2高效液相色谱-质谱联用法（HPLCMS）5【色谱条件】色谱柱：KroamsilODS，5m，250mm×46mLmmmL1D；流动相：甲醇乙腈1%oA醋酸铵(46：23：31，v/v/v)；流速：0.7mlmin柱温箱：25离子化方式：电喷雾离子化；选择性离子检测(SlM)：阿司匹林137MCH3CO一；对乙酰氨基酚150MH传输电压：70V；干燥气流速：10mLmin；雾化室压力：30mLpsig；干燥气温度：300；毛细管电压：4000V【血浆样品处理】于试管中精密加入血浆0.5mL，并加入内标对乙酰氨基酚溶液20L（20ng/L），振荡10s，在加入0.1mol/L HCl 0.1mL，振荡30s，然后加入5mL有机溶剂（氰仿一异丙醇95：5 vv)，振荡2 min，于3000r/min离心10min。将下层有机相定量4mL转移至另一试管中，冰水浴氮气流吹干。用200L流动相溶解残渣，于18000r/min，4离心10min，将上清液分成两份（各80L），分别用HPLC-MS和HPLC-UV进行测定，进样量均为20L。所有血样处理的操作均在冰浴中进行。【标准曲线的绘制】精密称取不同量的阿司匹林标准液，分别加入0.5mL空白血浆，使成每毫升20.0，40.0，100.0，200.0，400.0，1000.0，2000.0ng的阿司匹林标准溶液，按“血浆样品处理”项下操作，记录峰面积。以样品的离子流峰面积（As）与内标的离子流峰面积（Ais）的比值（f）对浓度（C）作直线回归，得回归方程。【样品测定】精密移取适量血浆样品，按血浆样品处理项下操作，20L进样，记录离子流峰面积。【计算】采用标准曲线法 f=a+bC a，b为常数，C阿司匹林的浓度，f为阿司匹林的离子流峰面积与内标的离子流峰面积的比值。 2阿司匹林在体外的含量测定方法2.1 阿司匹林原料药体外含量测定2.1.1酸碱滴定法2.1.1.1直接滴定法6【原理】 【方法】取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L相当于18.02g的C9H8O4。）【计算】 F为氢氧化钠滴定液的校正因数；T为氢氧化钠滴定液的滴定度；V为消耗氢氧化钠滴定液的体积；W为供试品的称取量。【讨论】阿司匹林在水中微溶，易溶于乙醇，故使用乙醇为溶剂。乙醇对酚酞指示剂显酸性，可消耗氢氧化钠而使测定结果偏高，因此乙醇在使用前需先用氢氧化钠中和至对酚酞指示剂显中性。滴定应在不断振摇下稍快进行，以防止局部碱浓度过大，致使阿司匹林酯结构水解。温度在040范围内对测定结果无显著影响。本法缺乏专属性，易受阿司匹林的水解产物水杨酸及醋酸的干扰，不适用于水杨酸含量较高的试样测定。72.1.1.2水解后剩余量滴定法7【原理】利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的特性，加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯键水解，再利用硫酸滴定液回滴剩余的氢氧化钠滴定液。【方法】取本品约1.5g，精密称定，加氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）50.0mL，混合，缓缓煮沸10分钟，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/L）滴定，并将滴定结果用空白实验校正。每1mL硫酸滴定液相当于45.04mg的C9H8O4。【计算】 V0和V分别为空白实验和样品测定时消耗硫酸滴定液的体积；W为供试品的称取量；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为硫酸滴定液的滴定度。【讨论】碱液在受热时易吸收二氧化碳，生成碳酸盐，当用酸回滴时，酸滴定液的消耗体积会减小，使测定结果偏高，故需在相同条件下进行空白试验校正。2.1.2反相高效液相色谱法李琳丽等建立了一种适用于阿司匹林稳定性及其降解动力学研究含量测定的反相高效液相色谱法。选用ShimadzuODS柱(250mm×4.6mm，5m)，以乙腈为溶剂，流动相为甲醇水冰醋酸(40：60：6，盐酸调节pH为2.5)，检测波长280nm，柱温40，流速为1.0mL/min，采用导数色谱法鉴定了色谱峰纯度。结果显示在选定色谱条件下，阿司匹林能与相邻杂质完全分离。阿司匹林在601800g/mL范围内，峰面积与浓度线性关系良好(r=0.9998)；平均回收率为100.6，RSD为1.3，重复性试验RSD为0.9(n=5)。高、中、低3个浓度的精密度试验RSD均小于1.4(n=5)。该方法快速简便，结果准确可靠，可作为阿司匹林稳定性及降解动力学研究的含量测定方法。8【方法】精密称取样品150mg，置50mL量瓶中，加意境适量溶解并稀释至刻度；精密称取10mL，置25mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取15L注入液相色谱仪，记录峰面积。制备对照品溶液（含阿司匹林1200g/mL）15L，同法测定，按外标法计算阿司匹林含量。【计算】CX、CR分别为供试液和对照品溶液的浓度，AX、AR分别为对应的色谱吸收峰面积。【讨论】本方法采用乙腈为溶剂，防止阿司匹林分解；选择流动相为甲醇-水-冰醋酸（40：50：6），并用盐酸调节PH为2.5，此条件下峰形和出峰时间理想，无拖尾；适当升高柱温能改善峰形和增加主峰与杂质峰的分离度，减小柱压。2.1.3动力学光度法杨军等根据乙酰水杨酸和碘容易发生取代反应，使碘的浓度降低，导致碘的催化作用减弱，建立了动力学光度法测定痕量乙酰水杨酸的新方法，确定了测定条件，对实际药品含量的测定有较高的准确度。9【原理】通常情况下Ce4+ + H3ASO3 + H20 = Ce3+ + H3ASO4 + 2H+的反应速度很慢，加入I-后反应便迅速进行，反应机理可能是： 2Ce4+ + 2I- 2Ce3+ + I2 I2 + H20 HIO + H+ + I- H3ASO3 + HIO H3ASO4 + H+ + I- 中间体I2容易在阿司匹林分子中-COOH的间位（即-OCOCH3）发生取代反应。如果固定I-的浓度，加入乙酰水杨酸后I2及I-的浓度降低，催化作用也降低，导致Ce4+与H3ASO3的反应速度减慢，终止反应后通过测定剩余Ce4+的量，得知加入阿司匹林的量。【方法】于一系列25mL比色管中准确加入0.25mg/L KI溶液1.0mL，5mol/L H2SO4溶液1.25mL，0.013mol/L As2O3溶液1.0mL，乙酸水杨酸标准溶液(或样品溶液)，加蒸馏水至25mL刻度线。摇匀并放人35土0.1的水浴中，恒温后加入0.01mol/L (Ce(SO4)2 1.0mL，立即摇匀，迅速放回水浴中。反应10min后，加入0.5m1 0.5%的醋酸马钱子碱终止反应并与Ce4+显色，置于沸水浴中煮沸3min，取出冷却至室温用lcm比色皿，在波长520nm处，以蒸馏水为参比，测定吸光度A。【计算】CX、CR分别为样品和对标准品溶液中阿司匹林的浓度，AX、AR分别为对应的吸光度。【讨论】与常用的酸碱滴定法和分光光度法相比，本法具有较高的准确度和精密度，适用于痕量阿司匹林的含量测定。2.2司匹林制剂体外含量测定2.2.1酸碱滴定法2.2.1.1两步滴定法10【原理】第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂，同时中和阿司匹林的游离羧基，以消除干扰；第二步为水解后进行剩余滴定法。第一步：中和各种游离酸阿司匹林：水杨酸：醋酸：枸橼酸： 第二步：水解和测定定量过量： 剩余：【方法】取本品10片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于阿司匹林0.3g），置锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20mL，振摇，使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至溶液显粉红色。再精密加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）40mL，置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硫酸滴定液（0.05mol/L）相当于18.02mg的C9H8O4。【计算】 V0和V分别为空白实验和样品测定时消耗硫酸滴定液的体积；W为供试品的称取量； F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为硫酸滴定液的滴定度；为供试品的平均片重；标示量为片剂的规格。【讨论】两步滴定法系水解后剩余量滴定法的改进。第一步中和时以溶液出现粉红色30秒不退即可，消耗的氢浙大药物分析实验教材氧化钠不必计量。再精密加入40mL氢氧化钠滴定液，水浴加热应在15分钟以上并时时振摇，保证水解完全。第二步为水解后剩余滴定法，在剩余滴定法中常需同时进行空白试验。2.2.2 光谱法2.2.2.1 比色法 利用阿司匹林在碱性条件下能定量水解成水杨酸的特性，采用比色法即水杨酸遇硫酸铁铵指示液显紫色并在530nm±1nm处测定其吸收度，求得水杨酸的量再折算成阿司匹林的量。高革、王福慧将阿司匹林锌用0.1mol/L NaOH溶液定量水解后，用比色法测定了其中阿司匹林的含量。11【对照液的制备】精密称取水杨酸适量置1000mL容量瓶中，加水溶解后，加冰醋酸1mL，再加水稀释至刻度，摇匀，配成100g/mL的对照液。【供试品溶液的制备】取阿司匹林锌约0.4g，精密称定，加水20mL，再加0.1mol/L NaOH液25mL，煮沸并保温30min，放冷后移至250mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀、滤过，弃去初液，精密量取续滤液10mL,置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。【样品测定】取本品约0.4g，精密称定，加乙醚4mL，不断搅拌。用乙醚润湿滤纸，滤过，滤渣用乙醚洗涤3次，每次约2mL，滤渣及滤纸全部移至烧瓶中，加水20mL，再加0.1mol/L NaOH液25mL，煮沸并保温30min，放冷后移至250mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10mL置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。分别量取对照液及样品液10mL，置25mL量瓶中，分别各加入0.01mol/L HCl溶液2.0mL，硫酸铁铵指示剂2.0mL，再加水稀释至刻度，摇匀。在530nm分别测定其吸收度。【计算】 A样、A对照分别为样品和对照品的吸收度，C对照为对照液的浓度，D为稀释倍数，W为样品取样量。【讨论】样品液浓度与光吸收值呈简单的线性关系，测定结果相对偏差小，重现性好。样品水解时加碱量及显色时加酸量一定要足够，否则结果偏低或偏高。原料中的游离水杨酸可用乙醚提出后再进行测定。2.2.2.2 双波长紫外分光光度法 池秀珍采用双波长紫外分光光度法（测定波长为276nm和322nm），测定了阿司匹林肠溶片的含量，可消除水解产物水杨酸的干扰。12【标准曲线的绘制】精密称取阿司匹林对照品适量，用乙醇溶解使成1000g/mL的溶液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分置于25mL量瓶中，加乙醇至刻度，分别制成40、60、80、100和120g/mL的对照品溶液，以乙醇为空白，分别在276nm、322nm波长处测定吸收度，以浓度C对A进行线性回归，得回归方程：C=3.8×10-4+1.5403×10-1A，r=0.9999（n=5）【样品测定】取阿司匹林肠溶片10片（小剂量20片），精密称定，研细。精密称取约相当于阿司匹林50 mg于50mL量瓶中，加乙醇适量，振摇使溶解并定容，摇匀，滤过。精密量取续滤液2mL于25mL量瓶中，加乙醇至刻度，以乙醇为空白，分别在276、322nm波长处测定吸收度，用回归方程计算阿司匹林的含量。【计算】将样品在276和322nm处的得的吸收度计算得的A，代入标准曲线，求得样品中阿司匹林的浓度。 2.2.2.3 双波比值光谱法 孙增先等应用双波长比值光谱法测定了复方乙酰水杨酸片中阿司匹林、非那西丁、咖啡因三种组分的含量，结果显示阿司匹林（A）在520g/mL，非那西丁（P）在210g/mL，咖啡因（C）在g/mL浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为100.3%，100.23%，99.96%。该方法适用于吸收光谱严重重叠，组分间互相干扰的复方制剂，测定波长少，计算简单，对仪器的要求不高。13【基本原理】在含L，M和N的三组分药物中，如果三组分在整个波长范围内的吸收符合比尔定律，则混合组分的吸收光谱可用方程式表示为其中为混合组分在波长i处的吸收度；，和分别为组分L，M和N在波长处的吸收系数；CL，CM和CN分别为组分L、M和N在混合物溶液中的浓度。若以L为干扰组分，在对应波长处用标准浓度CL。的吸收光谱· CL除(1)式，得：(2)式为混合组分相对于浓度为CL的L组分的比值光谱，其中组分L在/比值光谱中为一组平行于波长轴的直线，在任意波长处的吸收度比值RL都相等，即为CL/CL；可根据双波长等吸收度法，选择测定M组分的两个波长，使N组分在此两波长处的吸收度比值相等；由此消除了组分L和N对M组分的干扰，从而对M组分进行定量。【仪器与试剂】岛津UV-260型紫外一可见分光光度计；752-C型紫外-可见分光光度计。A和P为ChemService公司产品，C为Sigrrm公司产品，批号分别为186-74B、194-13B和97H3504。APC为山东新华制药股份有限公司生产，批号为、和。【标准储备液的配制】分别精密称取A11mg，P5mg和C5mg，分置于50mL量瓶中，用适量乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。【比值光谱绘制及测定波长选择】精密吸取A，P和C标准储备液适量，分置于25mL量瓶中，用乙醇稀释至刻度并摇匀；以乙醇为空白，在200340nm波长范围内扫描，得到A，P和C的吸收光谱（图1）。分别计算波长处A和P的吸收度对C吸收度的比值RA/C和RP/C，RA/C和RP/C对作图，得到A和P对C的比值光谱（图2）；同样，如果以A为参比，也可以得到P和C对A的比值光谱（图3）。由图2可以看出，A和P分别在227nrn和245nm处有最大R值，结合等吸收度理论，P在265nm处R值与227nm处相等；A在213nm处R值与245nm处相等，故选择213，227，245和265nm作为测定A和P的波长。由图3可以看出，C在265nm处有最大R值，在227nm处有最小R值，故227和265nm也是测定C的波长；在样品测定时，先扣除P在这两波长处对R的贡献，再对C进行定量。【标准曲线的绘制】精密吸取C和A标准储备液适量，分置于25mL量瓶中，用乙醇稀释至刻度并摇匀，作为标准参比溶液(C为7.1g/mL A为16.6/g/mL)。分别在213，227，245和265nm处测定吸收度。结果见表1。分别精密吸取A，P和C标准储备液适量，分别用乙醇稀释至一定浓度，得到A，P和C的系列标准溶液。A系列标准溶液在227和265nm处测定吸收度，以C为参比，计算RA/C：以对A的浓度作线性回归分析，结果见表2。A系列标准溶液在213，227，245和265nm处测定吸收度，先以C作参比，计算RP/C：以RP/C对A的浓度作线性回归分析，得回归方程。以RP/A对P的浓度作线性回归分析，得回归方程。结果见表3。C系列标准溶液在227和265nm处测定吸收度，以A为参比，计算RC/A以RC/A对C的浓度作线性回归分析，得回归方程。结果见表4。由P的浓度算出，C在这两波长处的RC/A=R（C+P）/ARP/A，代入回归方程，即可算出C的浓度，结果见表5。【精密度试验】按处方比例，取A，P，C和辅料适量，研磨混匀。精密称取上述粉末适量(约相当于A55mg)，按样品测定项下方法测定A，P，C含量，考察方法的精密度，结果A，P，C的日内误差(RSD，n=5)分别为0.24，0.73和0.79，日间误差(RSD，n=5)分别为0.33，0.96和1.24。【样品测定】取本品20片，精密称定，研细。精密称取适量(约相当于A55mg)，置入100mL量瓶中，加乙醇适量，振摇数分钟，使A，P和C溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤；精密吸取继滤液2.5mL，置入100mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度并摇匀；分别在213，227，245和265nm波长处测定吸收度，按回收试验项下计算A，P，C含量，并与法定方法比较，结果见表6。【计算】先以C为参比，按和计算RA/C和RP/C，代入回归方程，算出A和P的浓度。再以A为参比按计算出在227和265nm处的R(C十P)/A，P在这两波长处的RP/A，可由P的浓度算出，C在这两波长处的RC/A=R(C+P)A一RP/A，代入回归方程，即可算出C的浓度。2.2.2.4同步扫描荧光法魏永峰等建立了同步扫描荧光光谱法单次扫描同时测定阿司匹林和水杨酸双组分的方法。荧光广度计同步扫描时，得到两组互不干扰的荧光峰，可借此分别测定两组分的含量。阿司匹林和水杨酸浓度分别在4.0×10-61.0×10-4mol/L，8.0×10-71.0×10-4mol/L范围内与荧光强度呈线性关系，相关系数分别为0.9949和0.9975，水杨酸的检测限为4.0×10-7mol/L。14【原理】物质的荧光强度 F与激发光的波长和发射光的波长有关，固定发射波长为335nm时所得到阿司匹林的荧光激发光谱最大，固定发射波长为285nm时所得发射光谱具有最大的荧光强度。设两物质的em-ex分别为1，2，使得1<<2,这样就可以在一次扫描中同时得到两种物质的荧光光谱。研究表明以=80nm作为二组分同时测定的波长差最佳。【方法】荧光分光光度计置于同步扫描状态，带通Ex和Em宽度（带通）均为5nm，扫描速度为高速，响应时间为2s，=80nm。以2%Hac-CHCl3为溶剂配制2 x 10-3 mol/L的阿司匹林和水杨酸溶液作为标准液，移取不同体积的溶液制作二组分的工作曲线，并在相同条件下测定二组分含量。 取一定量阿司匹林制剂的样品，配制成一定浓度溶液，按同样方法以=80nm进行同步扫描测定。【计算】在4.0×10-61.0×10-4mol/L范围内用机绘制阿司匹林标准工作曲线方程：F=bC+a，样品的浓度即可从方程中计算得到。F为荧光强度，C为被测物质的浓度，a和b为常数。【讨论】本法测定速度快，准确度较高，方法简单，体系荧光性质稳定，只须单次扫描即可用于阿司匹林和水杨酸的同时测定，两组分互不干扰，适用于制剂中阿司匹林和水杨酸的同时测定。2.2.2.5萃取-火焰原子吸收光谱法 朱铿等以火焰法测定有机相中铜的原子吸收信号，间接求的阿司匹林的含量，建立了一种原子吸收光谱法间接测定阿司匹林的新方法，并用于实际样品正痛片（锦州制药厂生产）中阿司匹林的含量测定。15【原理】在一定条件下，阿司匹林与新铜试剂-铜形成离子对，它可被甲基异丁基甲酮萃取，测定有机相中铜离子的浓度，间接求得阿司匹林的含量。【火焰原子吸收测定条件】光谱通带0.5nm；波长324.8nm；灯电流2mA；燃烧器高度20mm；空气流量8.0L/min；乙炔气流量1.6L/min；积分时间2s。【溶液配制】阿司匹林标准溶液：准确称取阿司匹林纯品0.9008g，加入分析纯（95%）乙醇20mL溶解，于500mL容量瓶中以水定容，使其浓度为1.00×10-2mol/L,使用时逐级稀释。 新铜试剂铜溶液：称取分析纯新铜试剂2.300g加入50mL分析纯(95%)乙醇溶解；再加入分析纯CuSO4·5H2O 1.250g，使其完全溶解，于500mL容量瓶中以水定容。新铜试剂-铜溶液浓度为0.01mol/L。硫脲溶液：称取分析纯（NH2）2CS 0.95g，溶解定容于500mL容量瓶中，使其浓度为0.025mol/L。缓冲溶液：由KH2PO4和K2HPO4配制。【方法】在10.0mL磨口具塞刻度试管中，分别依次加入 1.0mL新铜试剂铜溶液，l.0mL (NH2)2CS溶液，5.0mL缓冲溶液及1.0mL阿司匹林标准溶液(或试样溶液)。准确加入 2.0mL甲基异丁基甲酮（MIBK），手摇1min，离心分离。测定有机相中铜的吸收信号（即响应于阿司匹林的铜的吸光度），以未加阿司匹林溶液的MIBK提取溶液为空白。【计算】将阿司匹林标准溶液按本法操作，用计算机计算得阿司匹林标准工作曲线，得回归方程：A=bC+a，将样品的测的A值带入方程，求得C。【讨论】本方具有法线性范围宽、重现性好、环境污染小、简便、快速等特点，但对仪器和试剂有一定的要求。2.2.3色谱法【计算】（1） 外标法：外标法一点：C供、C对分别为供试品和对照品的浓度；A供和A对分别为其对应的峰面积；D为稀释倍数（2）标准曲线法：（3）内标法： AS为内标物的峰面积（或峰高）；AR为对照品的峰面积（或峰高）；CS为内表物质的浓度；CR为对照品的浓度。 AX为供试品的峰面积（或峰高）；CX为供试品的浓度；为对照品的浓度。AS CS分别为内标物质的峰面积（或峰高）；D为稀释倍数；W为取样量。2.2.3.1高效液相色谱法（HPLC） HPLC法是体外测定阿司匹林制剂最常用的方法，因其操作简便、快速，结果较准确，适用于多种阿司匹林制剂（包括复方直接）的含量测定。下面了例举三个已有的研究。 吕莉16建立了用HPLC法同时测定复方单硝酸异山梨酯阿司匹林片中2种组分（单硝酸异山梨酯、阿司匹林）和主要降解产物水杨酸的方法。方法：采用Hypersil BDS C18（250m ×4.6mm，5m）色谱柱，流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇（60：40，用磷酸调节pH至2.8±0.1)，流速1.0mL/min，检测波长220nm，柱温40，进样量10L。结果：线性范围分别是：单硝酸异山梨酯0.01191.19mg/mL，r=0.9998(n=6)；阿司匹林0.011.0mg/mL，r=09996(n=6)；水杨酸0010121.012mg/mL，F：09985(n=6)。平均回收率：单硝酸异山梨酯>99.0，RSD为<1.0；阿司匹林>99.0，RSD为<0.9。 王晓燕17等建立了复方阿司匹林片剂的含量测定方法。采用Spherisorb ODS柱（250m ×4.6mm，5m），流动相：乙腈：0.08mol/L醋酸钠溶液（15：85），流动相中含0.12%的三乙胺作扫尾剂，并用并速算调PH为3.65，流速：0.8mL/min，检测波长：280nm，柱温：25，进样量：10L。结果测得阿司匹林0.45.2mg/mL呈线性，平均回收率为100.2%（RSD=0.67%，n=9）；磷酸可待因0.0080.104mg/mL呈线性，平均回收率为98.7%（RSD-=2.21%，n=9）。 李秀梅、张伟18建立以高效液相色谱法同时测定复方对乙酰氨基酚片中对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林含量的方法。方法：色谱柱为ODS，流动相为甲醇-4.2的冰醋酸溶液(3：7)，流速 为 1.0ml/min，检测波长为 275nm，进样量为 20 L，柱温为 25。结果 ：对 乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林的线性 范围分别为 160842880g/mL(r= 0.9 981)、3.4291.20g/mL (r= 0.9 988)、 23.87769.92g/mL l(r= 0.9 999)，平均回收率分别为 99.2 (RSD= 0.23)、100.4 (RSD=0.63)、99.3 (RSD=0.11) 2.2.3.2反相高效液相色谱法（RP-HPLC） 南楠、朱霁虹建立了一种用反相高效液相色谱法测定阿司匹林可待因片中阿司匹林和可待因的方法。该方法不需经提取分离，溶解后直接进样，简便、快速，准确可靠。19【色谱条件】色谱柱：-Bondapak ODS C18（10m，300×4mm）； 流动相：甲醇0.03mol/L醋酸钠（冰醋酸调PH=3.5）（1：2：5） 检测波长：280nm； 流速：1mL/min【对照品溶液配制】准确称取阿司匹林对照品约40mg置10mL容量瓶中，加入甲醇23mL，溶解。【供试品溶液配制】精确称取样品细粉适量（约相当于阿司匹林400mg）置100mL容量瓶中，加入25%甲醇溶液50mL，超声溶解5min。用25%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。经0.45m微孔滤膜滤过，取续滤液为供试品溶液。【测定】精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10L，分别注入液相色谱中，记录峰面积，计算供试品溶液的含量。2.2.3.3大口毛细管气相色谱法20【色谱条件】色谱柱：HP-1(5m×053mm×265m)石英毛细管柱；汽化室温度：230；检测器温度：260；柱温采取程序升温：起始180( 1 min) 230(2 min)；载气 (高纯N2)流速：10mL/min，分流比1：10；空气流速：350mL/min，氢气流速：35mL/min，【标准溶液配制】取阿司匹林适量，加冰醋酸2mL，然后用氯仿/乙醇（体积1：1，简称混合溶剂）配成浓度分别为40mg/L、20 mg/L、8 mg/L、5 mg/L标准溶液。【内标物溶液配制】移取适量正十六烷置于50mL的容量瓶中，用混合溶剂定容至刻度，配成20mg/L内标溶液。【样品处理】称取一定量药分（约相当于阿司匹林226.8mg）置25mL容量瓶中，加2mL乙酸和适量混合溶剂溶解，超声振荡15min，并用混合溶剂定容至刻度。待药物完全溶解后过滤，弃去10mL前滤液，取10mL中间滤液用混合溶剂稀释至所需浓度。取1mL一定浓度中间滤液，加5mL内标溶液用混合溶剂定容至10mL，摇匀。【测定】精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1L，分别注入液相色谱中，记录峰面积，计算供试品溶液的含量。2.2.3.4薄层色