IEF使用过程中常见问题及解决方法(共18页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上IEF使用过程中常见问题及解决方法以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。问题可能原因 解决方法初始电流低或为零 IPG胶条与电极接触不好. 检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上. PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全. 检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEAN IEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触. IPG胶条水化不完全 确保IPG胶条完全并平均地进行水化。检查水化液体积及水化时间. 在升压过程中电压不上升. 盐浓度过高 检查盐浓度并对样品进行除盐处理. 电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢 Bio-Lyte浓度过高 将Bio-Lyte 浓度降至 0.2% (v/v). 对不同尺寸的IPG 胶条和pH梯度电压设置过高. 在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦. 过多的样品在水化过程中未能进入胶条, 或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨 如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条, 或在聚焦前除去多余的样品液. 电压及电流波动很大. (同时电阻错误信息会显示) IPG胶条中有水化较差的区域, 或IPG 胶条在运行过程中已经烧干. 检查水化缓冲液体积及时间. 确保在水化期间水化缓冲液平均地分配. 限流过高. 建议限流50A/胶条. 确保输入正确的IPG胶条数目. 问题可能原因解决方法 烧胶条 (这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示.) 限流过高. 建议限流50A/胶条. 确保输入正确的IPG胶条数目. IPG 胶条已经烧干. 确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干 电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液. 确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态. 水化缓冲液成份不合适, 盐浓度过高. 检查水化缓冲液浓度。必要时重新配制缓冲液. 双向电泳实验中常见问题 一、 水平条纹出现的问题:胶上出现连续性横纹。可能的原因:蛋白质没有完全和稳定溶解。推荐解决的方法:· 用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS, ASB-14），两性电解质和还原剂（DTT or TBP）非常重要。每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液： o 89 M urea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte o 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 2 mM TBP or 50 mM DTT, 40 mM Tris, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 Ampholyte · 样品须有充分的溶解时间和变性时间。通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。 · 进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（>10,000 rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。 推荐产品:ReadyPrep protein extraction kit (total protein/全蛋白)出现的问题:出现不连续的横纹。可能的原因:样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA, RNA),脂类,多糖和酚类化合物。推荐解决的方法:以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud （1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理 （Damerval et al. 1986）,也可选用ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。最终，样品中SDS的含量须低于0.25% (w/v)，样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：1。如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。在样品中加入 0.1x solution containing 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mM MgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意：Mg2+离子是DNase活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。建议通过TCA/丙酮沉淀(Damerval et al. 1986)；或者醋酸铵沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit处理样品。脂类：蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前, 须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物(Wessel and Flugge 1984)。酚类化合物：植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。1. 酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone (PVP) or polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)吸附。2. 样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。3. 氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。4. 裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物 如 TCA/丙酮 (Damerval et al. 1986).，可以抑制酚氧化。推荐产品:ReadyPrep 2-D cleanup kitBio-Spin/Micro Bio-Spin 6 columns出现的问题:出现不连续的横纹。可能的原因:样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂(SDS),肽类,核酸类(e.g.DNA, RNA),脂类,多糖和酚类化合物。推荐解决的方法:以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。更详细的信息请参阅Rabilloud （1996）.盐：为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理 （Damerval et al. 1986）,也可选用ReadyPrep 2-D cleanup kit。沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。阴离子去污剂：SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。最终，样品中SDS的含量须低于0.25% (w/v)，样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：1。如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。核酸：处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。在样品中加入 0.1x solution containing 1 mg/ml DNase I, 0.25 mg/ml RNase A, and 50 mM MgCl2 而后冰浴 (Blomberg et al. 1995). 注意：Mg2+离子是DNase活性所必须的。多聚糖类：同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。建议通过TCA/丙酮沉淀(Damerval et al. 1986)；或者醋酸铵沉淀后酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986)；或者使用 ReadyPrep 2-D cleanup kit处理样品。脂类：蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前, 须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物(Wessel and Flugge 1984)。酚类化合物：植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。1. 酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone (PVP) or polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)吸附。2. 样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。3. 氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。4. 裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物 如 TCA/丙酮 (Damerval et al. 1986).，可以抑制酚氧化。推荐产品:ReadyPrep 2-D cleanup kitBio-Spin/Micro Bio-Spin 6 columns出现的问题:胶部分出现横纹。可能的原因:蛋白上样量过高。推荐解决的方法：a）稀释样品，降低样品浓度。在进行IEF前，须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。b）使用长IPG胶条，和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量，详细请见下表： IPG Strip Length 7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 µl185 µl300 µl315 µl410 µlProtein loadSilver stain520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgSYPRO Ruby520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgCoomassieBlue G-25050100 µg100200 µg200400 µg200400 µg400800 µgc）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70-90%。如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖对其他蛋白的观察。减少或除去样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹，有利于对低丰度蛋白的观察。推荐产品：a) RC DC protein assayb) PROTEAN Plus (24 cm) or PROTEAN II (17 cm) precast gelsc) Aurum serum protein and Aurum Affi-Gel Blue mini kits 出现的问题:胶部分出现横纹。可能的原因:蛋白上样量过高。推荐解决的方法：a）稀释样品，降低样品浓度。在进行IEF前，须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。b）使用长IPG胶条，和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量，详细请见下表： IPG Strip Length 7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 µl185 µl300 µl315 µl410 µlProtein loadSilver stain520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgSYPRO Ruby520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgCoomassieBlue G-25050100 µg100200 µg200400 µg200400 µg400800 µgc）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70-90%。如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖其他蛋白的观察。去处样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹，有利于低丰度蛋白的观察。推荐产品：a) RC DC protein assayb) PROTEAN Plus (24 cm) or PROTEAN II (17 cm) precast gelsc) Aurum serum protein and Aurum Affi-Gel Blue mini kits 出现的问题:胶上出现横条纹。可能的原因:IEF条件没有优化。推荐解决的方法：· 通过一系列聚焦时间实验，优化聚焦时间程序。例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条(20 kV-hr, 30 kV-hr, 40 kV-hr, etc.)。· 确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF，通常IEF聚焦时设置一个总电流。如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流。因此不同导电性质的样品，应该分别进行IEF。 出现的问题:胶上出现横条纹可能的原因:IEF条件没有优化。推荐解决的方法：· 通过一系列聚焦时间实验，优化聚焦时间程序。例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条(20 kV-hr, 30 kV-hr, 40 kV-hr, etc.)。· 确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF，通常IEF聚焦时设置一个总电流。如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流。因此不同导电性质的样品，应该分别进行IEF。 推荐产品：PROTEAN IEF cellReadyStrip IPG strips出现的问题:在碱性端附近出现横条纹。可能的原因:DTT含量不足，造成双硫键被氧化。推荐解决的方法：· 推荐解决的方法：在样品进行等电聚焦前，用TBP/IAA烷基化还原样品(Herbert et al. 2001). 在IEF中，必须解决碱性蛋白易在碱性环境中较易形成双硫键的问题，而TBP/IAA可以防止双硫键重新形成。通常而言，样品水化液和平衡缓冲液中的DTT是用于打开双硫键并保持其还原状态的。但是DTT在碱性中去质子而带负电，并可从碱性端迁移出IPG胶条而使蛋白质中的硫醇键再氧化形成分子内的双硫键。为使实验方便起见，BIO-RAD公司提供了ReadyPrep reduction-alkylation kit 以去除双硫键。· 为增加碱性蛋白的分离，可以在IPG水化液水化胶条后，采用在阳极端杯上样的方法上样。 推荐产品：ReadyPrep reduction-alkylation kitCup loading tray二、 垂直条纹出现的问题:在加样电极一端出现垂直条纹。可能的原因:蛋白出现聚集或者沉淀。推荐解决的方法：· 稀释样品，在样品进行IEF前须对样品分析和定量，以确保正确的上样量。样品上样量通常和IEF时所选用的IPG胶条的长度和染色方法有关。详细请见下表：  IPG Strip Length 7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 µl185 µl300 µl315 µl410 µlProtein loadSilver stain520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgSYPRO Ruby520 µg2050 µg5080 µg5080 µg80150 µgCoomassieBlue G-25050100 µg100200 µg200400 µg200400 µg400800 µg· 延长起始阶段低电压的时程，并逐步升压。详细见下表: StepVoltageTime1150 V>3 hr2300 V1 hr3600 V1 hr41,200 V1 hr51,200 V10,000 Vlinear gradient1 hr610,000 Vsteady-state推荐产品：RC DC protein assayPROTEAN IEF cell 出现的问题:出现垂直的点状条纹可能的原因:a) 平衡时间过短b) SDS-PAGE胶的pH值错误c) 在平衡液中，SDS的浓度过低。推荐解决的方法：a) 延长胶条平衡时间，如有必要，可以平衡多达30分钟。b) 检查制SDS-PAGE胶时所用Tris-HCl的pH是否8.8。如果Tris-HCl的pH错误，那么SDS-蛋白复合物的迁移速度就会降低，从而产生垂直的点状条纹。c) 保证平衡液中的SDS浓度至少为2% (w/v)推荐产品：Bio-Rad precast gelsReadyPrep 2-D starter kit equilibration buffers I and IIResolving gel buffer (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8)出现的问题:条纹沿胶的纵轴垂直分布。可能的原因:IPG胶条水化不充分，IPG水化液太少。推荐解决的方法：· 确保所选择IPG胶条的相应水化液的用量正确。下表列出了不同长度胶条所需水化液的用量，但在实验中要按操作手册说明操作。 · 注意：如果IPG胶条的上样水化液中已经含蛋白样品，那么上样量不能超过所推荐的加样量。另一方面，上样量不足会使IPG胶条总蛋白上样量不足。  IPG Strip Length 7 cm11 cm17 cm18 cm24 cmRehydrationvolume per strip125 µl185 µl300 µl315 µl410 µl· 如果样品仅仅部分润湿胶条，蛋白样品在胶条上就会分布不均匀。必须将聚胶槽中的胶条轻轻沿聚焦槽来回拖动几次，以使样品能完全润湿整根IPG胶条。 推荐产品：ReadyStrip IPG stripsReadyPrep 2-D starter kit rehydration/sample buffer 出现的问题:胶上出现了单独垂直的空白条带。可能的原因:在IPG胶条和SDS-PAGE胶界面含有气泡推荐解决的方法：· 确保第二相SDS-PAGE胶的顶部为一直线，从而使IPG胶条和SDS-PAGE胶面完全紧贴。· 在IPG胶条加到SDS-PAGE胶面上后，应用琼脂糖凝胶覆盖，以免胶条滑动。尽量避免在覆盖琼脂糖时产生气泡。通常使用的琼脂糖浓度为0.5%或 1%。 使用前须完全溶解。 推荐产品：PROTEAN Plus overlay agarose (Catalog# 163-2092)ReadyPrep overlay agarose (Catalog# 163-2111)三、 其它出现的问题:点弯曲。可能的原因:灌制SDS-PAGE胶时，没有用覆盖液（如水饱和正丁醇）。推荐解决的方法：在灌制SDS-PAGE胶后，须立即在胶面顶部加覆盖液，如水饱和的(n-butanol, l-butanol, or t-butanol)。 水饱和正丁醇须纯净，并呈一直线平铺于胶顶部。  推荐产品：Bio-Rad precast gels出现的问题:胶的部分区域的点发生扭曲。可能的原因:SDS-PAGE没有完全均匀地凝聚，电泳玻璃板没有被卡紧。推荐解决的方法：· 确保各配胶所需的试剂浓度正确，如TEMED，APS和其他试剂。TEMED和APS的终浓度均为0.05%,长度超过20cm的SDS-PAGE胶所须的TEMED的终浓度为0.025%。配胶所需的APS须新制，因为APS极易吸湿，在溶于水后就会分解，并会失活。因此，应当确保APS在使用前新鲜配制。 · 聚丙烯酰氨凝胶过程和温度相关。如果气温过低，那么凝胶就会失败。因此须在室温时进行聚丙烯酰氨凝胶过程，如果温度过低，须对电泳玻璃板加热。 · 确保 spacers, 电泳玻璃板, 和密封装置 都紧密接触，并没有漏缝推荐产品：Bio-Rad precast gels出现的问题:胶上没有观察到高分子量的点。可能的原因:蛋白酶降解样品。推荐解决的方法：· 在样品制备时，加入蛋白酶抑制剂。· 使用尿素和硫脲制备样品，硫脲是一种高效的蛋白酶变性剂。 推荐产品：ReadyPrep total protein extraction kit出现的问题:点在垂直方向上成对出现。可能的原因:a) IPG胶条在SDS-PAGE胶上没有安置好。b) 在进行SDS-PAGE电泳时，PAGE胶出现一系列的温度差。推荐解决的方法：a) 确保整个IPG胶条和SDS-PAGE的顶部胶面紧贴。在PAGE胶上安置IPG胶条时，须使IPG胶条的支持膜面和电泳玻板长板紧贴，以确保IPG胶条完全伸展。推荐使用一长一短的电泳玻璃板组合，这样有利于IPG胶条的安置。b) 参阅电泳的操作手册，使用推荐的电泳条件并尽量减小电泳时的最大电流。推荐产品：Bio-Rad precast gelsBio-Rad glass plates and gel casting chambers出现的问题:在银染胶上出现弥散和不均匀的背景。可能的原因:染色不均匀，清洗步骤不足。推荐解决的方法：确保所须染色的SDS-PAGE胶浸入染色液中完全伸展，而且胶不能粘在染色盘底部。切勿一次在染色盘中放入过多SDS-PAGE胶。如有必要，可以多加几步清洗，染色盘须清洁，银染用水的质量须很高。推荐产品：Dodeca stainersDodeca silver stain kitSilver Stain Plus kit出现的问题:在银染胶上出现弥散和不均匀的背景。可能的原因:染色不均匀，清洗步骤不足。推荐解决的方法：确保所须染色的SDS-PAGE胶浸入染色液中完全伸展，而且胶不能粘在染色盘底部。切勿一次在染色盘中放入过多SDS-PAGE胶。如有必要，可以多加几步清洗，染色盘须清洁，银染用水的质量须很高。推荐产品：Dodeca stainersDodeca silver stain kitSilver Stain Plus kit专心-专注-专业