2022年双元表达载体系统.pdf

双元表达载体系统双元 表达载体 系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti 质粒，这类Ti 质粒由于缺失了TDNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供 Vir 基因编码表达Vir 蛋白的功能， VIR基因编码的virD2 蛋白相当于 反式作用 元件，能够识别 农杆菌 转运 DNA（T-DNA）两端 24bp 序列 ,进而将 T-DNA 以单链的形式切割下来，同时， VIR基因编码的virE2 能够与单链T-DNA 结合，形成T-复合物，在 核定位序列 的作用下，经过 宿主细胞 T4SS转运体系进入宿主细胞质 。之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的TDNA 的转移。另一部份是微型Ti 质粒 (Mini-Ti plasmid) ， 它在 TDNA 左右 边界序列 之间提供植株选择标记如 NPTII基因以及 Lac Z基因等。双元载体系统的构建的原理是Ti 质粒上的 Vir 基因可以 反式激活TDNA 的转移。与共 整合载体 所不同的是， 它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的 MCS和筛选标签的 融合蛋白 （通常是GFP或 Gus）的普通载体。另一个载体就是双元载体（ binary-vector ）了。通常我们是先将外源基因 插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的 35S promoter-expression gene-gfp 这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和 RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA 转染机制，将双元载体的LB和 RB之间的片段融合进宿主的基因组上。我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及 pZPZ211和 pAA 等 2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti 质粒， 这类 Ti 质粒由于缺失了TDNA 区域， 完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir 基因功能，激活处于反式位置上的T DNA 的转移。4.另一部份是微型Ti 质粒 (Mini-Ti plasmid) ，它在 TDNA 左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及 Lac Z基因等。5.双元载体系统的构建的原理是Ti 质粒上的ir 基因可以反式激活 TDNA 的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。6.外源 DNA 克隆到微型Ti 质粒TDNA 左右边界序列之间精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 双元载体标签 : 植物双元表达载体根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够通过感染植物的伤口，将其Ti 质粒上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA 转移并整合至植物受体的基因组中。 Ti 质粒中的2 个独立的区域决定DNA 转移及整合： T-DNA区 (transferredDNA)和 vir 区(virlence region) 。基于 Ti 质粒这个结构特点，1983 年 Hoekema 等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA 区从 Ti 质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元 Ti 载体 。vir 区则存在于一个已经除去T-DNA 的 Ti质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒 ，通过反式激活使T-DNA 转移到植物细胞基因组中。由于双元 Ti 载体的体积小而非常便于基因克隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti 载体，已成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。(1)病毒载体系统 :植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。 以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源荃因整合到植物细胞基因组中。 植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。作为病毒载体的病毒最好是双链DNA 植物病毒。目前己有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中:包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、更豆花叶病毒(CPMV)和马铃薯 X病毒 (PVX) 等。其中在TMV 载体中成功表达的外源病毒至少有150 种以上。(2)农杆菌质粒载体系统:质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti 质粒和 Ri 质粒。 r 质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumcfaciens ) 中， Ri质粒存在于发根农杆菌(Agxobacerium tlhixogenis) 中。 r 质粒和 Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用五质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移 和整合的天然系统。r 质粒有两个区域:T -DNA 区是质粒上能够转移整合入植物受体墓因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘦瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域)和 Vir区(编码能够实现TDNA转移的蛋白 )。TDNA 长度为 12 一 24kb 之间，两端各有一个含 25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的TDNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的 TDNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。Vir 区位于 TDNA 以外的一个 35kb 内，其产物对 TDNA 的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir 基因的表达。 Vir 产物能诱导Ti 质粒 产生一条新的 TDNA 单链分子。此单链分子从五质粒上脱离后，可以与场r 产物 VIRD2 蛋白共价结合，并在 V RD4和 V IRE等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。由于野生型Ti 质粒过于庞大，约200 一 S00kb，为了便于重组DNA 操作，研究人员对Ti 质粒进行了改造从精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 而构建一系列合适的Ti 衍生载体。 首先除掉了野生型Ti 质粒 TDNA 区 的一段 DNA 片段。 例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量 )。此外需在T 质粒上加上E. Coli复制起始位点，使得插入外源基因的r 质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在E. Coli中重组操作与保存。3 甲植物转化载体系统 (包括一元载体系统和双元载体系统)。人们在研 究中发现在T -DNA转移过程中，明 r 基因并不一定与T -DNA位于同一个质粒上，于是通过构建中间载体解决了T 质粒不能直接导入目的基因的困难。大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将T -DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中， 并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的Ti 质 粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T -DNA引入 Ti 质粒的有效方法。带有重组 TDNA 的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“ 中间载体 ”(intermediate 4wtor),而接受中间费休的Ti 质粒则森为等休T 质粒 ( aevenfor T nlasmid ) .一船早知甲费体或称 “ 缴械 ” 载体。在这种omc-载体中已经缺失的T DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒 pBR322 取代。这样任何适合于克隆在 pBR322质粒的外源DNA 片段都可以与pBR322 质粒 DNA 同源重组，而被其整合到one 一 Ti 质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的B. coli 小质 粒，这一点对下通过体外操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。根据两类中间载体，目前己开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统)， 这一类载体系统由一个共整合系统中问表达载体与改造后的受体卫质粒组成。在农杆菌内， 通过同源重组将外源基因整合到修饰过的TDNA上，形成可穿梭的共整合载体，在Vir 基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。另一类转化体系是双元载体系统，它由两个分别含有TDNA和 Vir 区的相容性突变Ti 质粒即 :微型 r 质粒(mini 一 plasmid)和辅助 Ti 质粒 (helper Ti plastnid) 构成，TDNA 和 Vir 基因在两个独立的质粒上， 通过反式激活TDNA 转移到植物细胞基因组内。微型 Ti 质粒就是含有TDNA 边界缺失 Vir 基因的 r 质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(oriv)，同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有Vir 区段但 TDNA 缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤的功能。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供Vr 基因功能。激活处于反式位置上的TDNA转移。将微型质位转入到含有辅助性Ti 质粒农杆菌的途径有两条 :一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞;另一条途径是采用三亲交配方法，三亲交配由含微型Ti 质粒的 E. Coli,含有助动质粒pRK2013 的和含有辅助 Ti 质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌问的接合转导。pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型 Ti 质粒的 E. Coli后，可促进微型Ti 质粒一起或分别转移入农杆菌中。但由于 pRK2013 的“ 自杀 ” 特性，最终在农杆菌中剩下微型Ti 质粒和 Ti 质粒双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。双元载体不需经过两个载体的共整合过程。因此构建的操作过程比较简单:由于微型Ti 质粒较小，并无共整合过程，因此质精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - - 粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。另外，双元载体在外源摹因的植物转化中效率高于一元载体。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - - -