分子生物学实验指导(共46页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5a菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验开题报告，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。因局部实验失败而没有取得预期的结果，无法进入下一步实验的小组，先要与教师讨论分析失败的原因，然后向其他成功组的同学或教师索取实验材料继续进行。分子生物学实验注意事项1实验一 质粒DNA的小量制备.2实验二 质粒DNA电泳鉴定.5实验三 质粒DNA的酶切.8实验四 PCR扩增制备目的基因.10实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断.13实验六 目的基因片段与载体连接.16实验七 感受态大肠杆菌的制备 .18实验八 感受态细菌的转化.20实验九 转化克隆的筛选和鉴定.22实验十 外源基因的诱导表达.26实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白.28附 录附录1：表达载体pET-Trx的相关资料.32附录2：从NIH查阅的nattokinase（纳豆激酶）序列之一.33附录3：DNA和蛋白质分子量Marker.34附录4：本实验所用的克隆载体图.34附录5：分子生物学大实验进度表（参考）.35附录6：实验流程参考图.36附录7：开题报告格式.37附录8：实验论文参考格式.41专心-专注-专业分子生物学实验注意事项1. 上实验课的学生每两人分为一个小组，登记领取微量移液器（1000mL, 200mL和10mL各一支）。2. 课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的目的，理清实验顺序。认真填写本科分子生物学实验论文开题报告，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。3. 实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体实验方案制定自己的实验顺序和计划。4. 实验指导中所写的实验操作技术和步骤仅供参考，学生在弄懂操作原理和目的的基础上多动脑筋，摸索适合自己的操作技巧。5. 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排，分别记录实验操作和结果。6. 实验指导中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，全部实验必须在10天之内完成。7. 每一步实验都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！8. 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是PCR仪、微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。9. 写作开题报告、实验记录和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作错误和结果失败）。10. 在实验室内不能大声喧哗。11. 在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放和处理。12. 实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。13. 值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。14. 实验时损坏的任何物品都要及时申报，并按照生命科学学院实验中心的有关规定进行适当的赔偿。15. 实验需要的油性记号笔、计时器（或手表）、卫生纸、白大衣、擦手毛巾等需要自备。实验一 质粒DNA的小量制备【实验目的】学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。【实验原理】 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，DNA双螺旋结构被解开而变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去，质粒DNA和小分子RNA留在上清液里，用乙醇沉淀即可得到质粒DNA。【实验用品】1. 器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，恒温摇床，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机，pH计，制冰机。摇菌试管洗净并盖上盖、1.5mL离心管装入不锈钢饭盒、吸头（10mL，200mL，1000mL）装入相应的吸头盒，一起高压（121°C 20min）灭菌。2. 试剂（1） LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121°C 20min灭菌。使用时加入氨苄青霉素，终浓度100mg/mL。（2） 氨苄青霉素储存液：无菌水配制100mg/mL，分装后-20°C保存。（3） 溶液 I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA ，调pH8.0（4） 溶液 II（NaOH/SDS溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，现用现配（5） 溶液 III KAc溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸调至pH4.8，补dd water至100mL（6） 10mg /mL RNase A：RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中（7） TE 缓冲液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0，高温高压灭菌（8） 95%和70%乙醇（9） 0.5mol/L EDTA pH8.0：称取18.61g Na2EDTA·2H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH颗粒调节PH值至8.0（约2g NaOH）使其完全溶解。加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌。（10） 1mol/L Tris HCl pH7.5：称取12.1g Tris碱, 加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH6.8（约加6.5mL）。让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4°C保存（11） 1mol/L Tris HCl pH8.0：称取12.1g Tris碱, 加80mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.0（约加4.2mL）。让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4°C保存3. 材料带有pET-Trx质粒载体的DH5a菌,带有pMD18-T-NK（纳豆激酶）载体的DH5a菌，保存在-80°C。【实验方法】1. 在超净工作台中分别吸取 5mL 和2 mL LB（Amp+），分别加入两支灭菌的摇菌管中。2. 从超低温冰箱中取出保存pET-Trx载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种，在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/mL 氨苄青霉素）中搅拌一下，操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！37°C摇床中摇过夜。pET-Trx菌： 接种于5mL LB（Amp+）pMD18-T-NK菌：接种于2mL LB（Amp+）3. 取1.5mL的菌液于1.5mL离心管中，10000r/min离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。pET-Trx菌： 3管（3×1.5mL）pMD18-T-NK菌：1管（1.5mL）4. 在沉淀中加入100mL 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置15min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的碎冰块备用。）5. 加入200mL 溶液II，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置15min。6. 加入150mL 溶液III，盖上盖后上下轻微颠倒几次混匀，插入冰中，放置15min。7. 14000r/min离心510min，小心吸取400mL 上清液于另一个干净的1.5mL离心管中，（不要将白色沉淀物带入！如带入可重新离心），加入800mL 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下（或冰上）静置510min。8. 14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，加入500mL 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，在卫生纸上倒置轻磕，尽量弃干净。9. 再加入500mL 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。14000r/min离心10 min，小心弃掉上清液，在卫生纸亦上倒置轻磕，尽量弃干净。10. 离心管倒置在37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。11. pMD18-T-NK加入30mL 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管pET-Trx质粒中每管加入10mL蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下（约2000r/min 1min），使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-Trx质粒中加入1mL RNaes A。用油性记号笔标记后放入4°C冰箱中备用。12. 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，撰写实验记录。13. 有条件的话，可以选作用分光光度计测定质粒DNA的浓度：用dd water稀释20倍，并以dd water为对照，在波长260nm，280nm及310nm处读OD值。通过下列公式计算DNA的浓度（mg/mL）：ssDNA浓度=33´（OD260OD310）´稀释倍数dsDNA浓度=50´（OD260OD310）´稀释倍数ssRNA浓度=40´（OD260OD310）´稀释倍数【思考题】1. 影响最终质粒产量的主要因素有哪些？2. 提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能地避免蛋白质的污染？实验二 质粒DNA电泳鉴定【实验目的】学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳技术。【实验原理】DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度和形态的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。【实验用品】1. 器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块。250mL三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，微量移液取样器，1.5mL离心管，双面微量离心管架，试管架，一次性薄膜手套等。2. 试剂（1） 50´TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1´。（2） 1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4°C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（3） 10´加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4） 6´加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量标准：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。 （6） 电泳级琼脂糖粉3. 材料pET-Trx质粒，pMD18-T-NK质粒，PCR产物或DNA酶切产物等。【实验方法】1. 称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25mL 1´TAE电泳缓冲液（注意原液是50´，需要自己稀释！），用保鲜膜盖住，放入微波炉中烧开（0.5min）。25mL 正好能倒满一块小胶。实验时可以根据需要少倒一些，以制作较薄的胶。如果电泳样品少的话，可与其他组共用一块胶，或在电泳结束后将带有DNA的胶切下来放入EB染色，剩下的胶块用保鲜膜包住放到4°C冰箱，以便下次再用。2. 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。3. 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至不烫手（约5060°C）。4. 把梳子（最细的齿）插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相差12mm即可，但尽量不要太厚，更不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置1020分钟待胶完全凝固。（如有剩下的胶溶液，封口后留待以后再熔化使用）。5. 在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至 10V/cm（170V），注意正负电极的位置连接正确。6. 待胶完全凝固后（1520分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极（黑色电极）。7. 取1小片光面纸，点6mL蒸馏水、1mL 10´加样缓冲液，再加入3mL质粒DNA溶液制成10mL DNA混合样品。在做PCR产物或酶切产物电泳的时候要根据DNA的量上样。8. 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10mL的吸液头分别将纸上的混合样品加入凝胶的加样孔中。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手指夹住移液器下部，以减少移液器的抖动。看到带有蓝色样品的吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中，切不可使蓝色样品流到孔外。在电泳PCR产物或酶切产物时，在相邻的加样孔中加入2mL DNA分子量标准物。9. 打开电源开关，170V电泳。样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。10. 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。将没有使用的凝胶部分切下来收入溶胶瓶，回收再用。11. 把带有样品的凝胶小心放入盛有EB的搪瓷盒中。以下需戴手套到专门的染色区操作。放置约10分钟后，取出来在自来水中浸泡10min。用自来水冲洗后放入凝胶成像系统中拍照。照片要以合适的文件名保存，以便写论文的时候调用。12. 染有EB的凝胶和手套（只要手套没破，可以节约使用：将手套脱下来以后张开口放在染色区，下一次把手伸进去即可）要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。不可用接触过EB的手套接触电脑或凝胶成像仪的门。13. 撰写实验记录。【思考题】1. 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？2. 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?3. 影响本实验结果的因素有哪些？实验三 质粒DNA的酶切【实验目的】学会用限制性内切酶切割DNA。【实验原理】 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳把酶切后的DNA片段混合物分离。可根据DNA上已知的酶切位点和预期的酶切结果，与DNA分子量Marker对比，判断酶切是否成功。【实验用品】1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴锅。移液器吸头、0.5mL和1.5mL微量离心管分别高压灭活。2. 试剂（1） 50´TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1´。（2） 1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4°C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（3） 10´加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4） 6´加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量标准：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。 （6） 电泳级琼脂糖粉（7） EcoR I和BamH I内切酶，10×内切酶缓冲液3. 材料pET-Trx质粒【实验方法】1. 先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。混合下列溶液于一个高压过的0.5mL微量离心管中：自提的pET-Trx 质粒DNA 8 L10×酶切缓冲液（用BamHI的缓冲液） 4 Ldd water 26 LEcoRI 1LBamHI 1L总体积 40L2. 加完质粒、缓冲液和水后，从-30°C冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。3. 用一只手的手指捏住盛放酶的微量离心管的上部（以免手指给酶液加温），另一只手持10L微量移液器，让吸头尖部刚好伸进酶液即可，吸取1 L EcoRI限制性内切酶。更换吸头后吸取1 L BamHI限制性内酶。吸完酶后立即把内切酶液送回冰柜！4. 在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后，轻轻震动微量离心管，使管中的溶液混匀。再在离心机中2000r/min离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在37°C水浴中酶切3-4 h。注意不同的内切酶的最适酶切温度不同。5. 取少量（约10L）酶切产物，与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物或Marker等）对比电泳（方法见实验二），以确认酶切是否成功。根据已知的酶切位点，判断酶切结果。6. 酶切后的目的片断可以回收备用（方法见实验五）。7. 清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验记录。【思考题】1. 酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？ 2. 如何估计DNA用量和酶的用量？3. 在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？实验四 PCR扩增制备目的基因【实验目的】学会PCR仪的设置和PCR操作的基本技术。【实验原理】 将待扩增的DNA模板加热至94变性，再降低温度与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性复性延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。复性温度可根据引物设计软件Oligo6或Primer5给出的引物Tm值确定，其中<25nt的引物的Tm值也可以用公式Tm=2（A+T）+4（G+C）计算。一般取低于Tm值2-5°C。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统。移液器吸头、0.2mL PCR微量管分别高压灭活。2试剂（1） 50´TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1´。（2） 1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4°C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。（3） 10´加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4） 6´加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量标准：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等。 （6） 电泳级琼脂糖粉（7） 3U/L Taq DNA聚合酶（8） 10×PCR缓冲液（MgCl2 free）（9） 25mM MgCl2（10） dNTP混合液（每种25mM）（11） 无菌dd water3材料（1） 模板质粒pMD18-T-NK：已经克隆在pMD18-T载体上的1181bp纳豆激酶（nattokinase，NK）基因（2） NK引物：上游引物（5端带BamHI酶切位点）5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'下游引物（5端带EcoRI 酶切位点）5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3' 待扩增的NK片段长度：837bp（825bp NK+5BamH I位点GGATCC，3EcoRI位点GAATTC）。【实验方法】1. 取1L自己提取的质粒pMD18-T-NK，加入9L dd water稀释作为PCR模板。2. 在0.2mL PCR 微量离心管中按下列参考剂量配制50L反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终浓度，实验时需参照Taq酶说明书计算） dd water 32L 10×PCR buffer（不含MgCl2） 5L 25mM MgCl2 3L 2.5mmol/L dNTPs 4L（每种dNTP终浓度0.2mM） 10mol/L Primer1 2L（12.525pmoles） 10mol/L primer2 2L（12.525pmoles） 模板质粒pMD18-T-NK 1L（1×10-3pmoles） 3U/L Taq酶 1L（3U） 总体积 50L3. 根据PCR仪的操作手册设置PCR仪的循环程序：（1） 94°C 5min （2） 94°C 1min （3） 60°C 1min （根据引物的Tm值设定）（4） 72°C 1min50s （根据所扩增的DNA的长度设定）（5） go to（2） 29 times（6） 72°C 10min4. PCR结束后，取510L产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见实验二）。观察胶上是否有预计分子量的主要产物带。5. 清理桌面，撰写实验记录。6. PCR产物可以直接与T载体连接（方法见实验六），然后转化感受态细胞（方法见实验八）。【思考题】1. 复性温度是根据什么确定的？2. 引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？3. 为什么要在最后延伸10min？4. 实验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？ 实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断【实验目的】学会用从琼脂糖凝胶中回收DNA片断。【实验原理】限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中。因此可以将某条特定的DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解，使DNA回溶到溶液中，再经过过柱，DNA片段被吸附到柱上，与溶液其它成分分开。经过乙醇洗涤杂质后，用TE缓冲液洗涤柱子即可回收目的DNA酶切片断。【实验用品】1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴锅，DNA凝胶回收试剂盒的柱子。移液器吸头和1.5mL 微量离心管分别进行高压灭活。2. 试剂（1） 50´TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱 242g，57.1mL冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1´（2） 1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/mL）：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4°C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可（3） 10´加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝（4） 6´加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液（5） DNA分子量标准：lDNA HindIII，Tiangen公司的Marker II或Marker III等（6） 电泳级琼脂糖粉（7） DNA凝胶回收试剂盒 3. 材料欲回收的DNA酶切产物：pET-Trx载体的EcoRI +BamHI酶切产物，pMD19-T-NK的EcoRI +BamHI酶切产物【实验方法】1. 用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶，使用较宽的梳子制备加样孔。2. 在胶上选定两个相邻的加样孔，分别加入少量（10L）（一般选择位于凝胶的边缘）和大量（3050L ）DNA酶切产物，电泳（方法见实验二）。3. 电泳结束后用薄塑料片（如电话卡）切下含有少量DNA酶切产物的泳道，EB染色。在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片在目的DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用EB染色，也不用紫外灯照射。4. 将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置。5. 用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个事先称量过的、灭活的1.5mL微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。6. 再用EB染色切除DNA以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把DNA带切走。7. 按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA酶切产物。不同的试剂盒的操作原理相同，但步骤稍有差别，应严格按照试剂盒的说明书进行操作。例如：（1）上海生工 UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤： 按400mL/100mg凝胶的比例加入Binding Buffer II，置于50-60水浴中10min，每2min混匀一次，使胶彻底熔化。将熔化的胶溶液移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。5000r/min室温离心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液。将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500mL Wash Solution，5000r/min室温离心1min。重复上一步洗涤一次。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回到同一个收集管中，12000r/min室温离心1min。将UNIQ-10柱放入一个新的1.5mL微量离心管中，在柱子膜中央加30mL Elution Buffer（或dd water，pH>7.0），室温或37放置2min（55-80洗脱效果更好）。8000r/min室温离心1min，离心管中的液体就是回收产物。（2）其它公司的试剂盒（如AXYGEN公司的AXYprep DNA Gel Extraction Kit）的操作步骤与上述大同小异，做实验时按照各家的产品说明书操作即可。8. 可取2l-5l回收产物电泳，检测是否有回收到的目的DNA带。9. 清理桌面，撰写实验记录。【思考题】1. 为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？实验六 目的基因片段与载体连接【实验目的】学会DNA片断的体外连接技术。【实验原理】 在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端连接成重组DNA分子。 【实验用品】1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴，恒温水浴，泡沫塑料保温盒。移液器吸头和0.5mL 微量离心管分别进行高压灭活。2试剂（1） T4 DNA 连接酶（2） 连接酶缓冲液（3） 无菌dd Water等3材料（1） pMD19-T 载体。NK PCR产物（2） EcoRI +BamHI酶切回收的pET-Trx载体。EcoRI +BamHI酶切回收的NK插入片断【实验方法】1. PCR产物与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或泡沫塑料保温盒里的水）温度调整到14°C。（2） 取一个高压灭活的0.5mL微量离心管，加入：PCR 产物混合液 4mLpMD19-T载体 1mLT4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 0.5mL连接酶缓冲液 1mLdd Water 3.5 mL总体积 10mL （3） 将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C水中保温过夜。（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞（方法见实验八）或置4°C冰箱备用。2. DNA回收片断（NK）与表达载体（pET-Trx）连接：（1） 取一个灭菌的0.5mL微量离心管，加入：NK片段回收产物 4mLpET-Trx载体酶切回收产物 1mLT4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/uL） 0.5mL连接酶缓冲液 1mLdd Water 3.5 mL总体积 10mL（2） 将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜。（3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞（方法见实验八）或置4°C冰箱备用。【思考题】1. 连接酶的最适活性温度是多少？2. 为什么要采用14°C下连接？3. 如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？实验七 感受态大肠杆菌的制备【实验目的】学会用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。【实验原理】 细菌在0°C的 CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。【实验用品】1器材旋涡混合器，微量移液取样器，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，接种环。摇菌试管、三角烧瓶、移液器吸头和0.5mL 微量离心管分别进行高压灭菌。2试剂（1） LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200mL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121°C 20min灭菌。（2） 0.1 mol/L CaCl2溶液，121°C 20min灭菌后存放在冰箱。（3） 无菌dd Water3材料E. coli DH5a，E. coli BL21（DE3）【实验方法】1. 取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mL LB培养基（不含抗菌素！）。2. 从超低温冰柜中取出DH5a菌种和BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mL LB培养基的试管中，37摇床培养过夜。3. 在超净工作台中取0.5mL上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h。4. 取少量菌液测定OD590为