DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分.精品文档.DNA和RNA提取方法及原理 和 提取方法及原理 DNA提取专题 DNA提取专题第一部分： 第一部分：DNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分： 第二部分：DNA提取常见问题分析及对策 提取常见问题分析及对策 前言 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 是遗传信息的载体， 是遗传信息的载体 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 了进行测序、杂交和基因的表达， 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。 是非常重要的前提。 量和高纯度的 是非常重要的前提 DNA提取原则 DNA提取原则保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法染色体DNA的提取 染色体DNA的提取 DNA CTAB法 法 SDS法 SDS法 其它 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法非染色体DNA的提取 的提取 非染色体 质粒DNA的提取 的提取 质粒 ? 碱裂解法 ? 煮沸法 线粒体、叶绿体 线粒体、叶绿体DNA的提取 的提取 ? 差速离心结合 差速离心结合SDS裂解法 裂解法 基因组DNA CTAB法 基因组DNA CTAB法 CTAB法原理（植物 提取经典方法） 法原理 植物DNA提取经典方法 提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 （ ， 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， ），是一种阳离子去污剂 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中（ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 ）是可溶的， 抽提，去除蛋白、多糖、 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 出来。 溶液在低于15 时会形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 溶液在低于 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 基因组DNA CTAB法 基因组DNA CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方 提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， DNP充分溶解 存在于液相中； 充分溶解， CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜 -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 巯基乙醇是抗氧化剂 CTAB提取缓冲液的改进配方 提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合 （聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物， 物质，有效去除多酚，减少 中酚的污染； 物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 中酚的污染 同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。 有效去除多糖。 基因组DNA CTAB法 基因组DNA CTAB法 CTAB法流程图 法流程图植物材料 裂解液酒精沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 基因组DNASDS法 基因组DNASDS法 SDS法原理 法原理 SDS是一种阴离子去垢剂， 在高温 （ 5565） 条件下能裂解细 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 是一种阴离子去垢剂 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 或 浓度并降低温度（ 提高盐 浓度并降低温度 冰浴） 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 用酚/氯仿抽提 上清液中的 用酚 氯仿抽提， DNA。 。 基因组DNASDS法 基因组DNASDS法 SDS法流程图 以动物组织为例） SDS法流程图 （以动物组织为例）动物组织抽提 离心洗涤 组织匀浆 上层溶液 干燥溶解 细胞裂解 酒精沉淀 DNA溶液 溶液 基因组DNA 基因组DNA其它方法根据细胞裂解方式的不同有： 根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式： 生物方式：酶法 基因组DNA 基因组DNA其它方法根据核酸分离纯化方式的不同有： 根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法： 吸附材料结合法： ? ? ? 硅质材料 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 pH值结合核酸 pH值洗脱 快捷高效。 快捷高效。 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 pH值结合核酸 pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。 从而达到分离目的。 基因组DNA 基因组DNA其它方法浓盐法： 浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 和 在盐溶液中溶解度不同， 利用 在盐溶液中溶解度不同 有机溶剂抽提法： 有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂， 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 密度梯度离心法： 密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 质粒DNA 质粒DNA碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 从而可通过离心将两者分开。 中，从而可通过离心将两者分开。 质粒DNA 质粒DNA碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体 上清液 沉淀 溶液I充分重悬 溶液 充分重悬 抽提 干燥溶解 溶液II裂解 溶液 裂解 酒精沉淀 质粒DNA溶液 溶液 质粒 溶液III中和 溶液 中和 离心洗涤 质粒DNA 质粒DNA煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； DNA在冷却时即恢复其天然构象 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 从而可通过离心将两者分开。 中，从而可通过离心将两者分开。 细胞器DNA 细胞器DNA差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器， 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 它们的比重和大小一定 比重和大小一定， 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法， 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。 种组分分级分离出来。 差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖） 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。 从而得以分离。 内容第一部分： 第一部分：DNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分：DNA提取及常见问题分析 第二部分： 提取及常见问题分析 DNA提取的基本步骤 DNA提取的基本步骤 I.材料准备 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜 II.破碎细胞或包膜内容物释放 破碎细胞或包膜 III.核酸分离、 III.核酸分离、纯化 核酸分离 IV.沉淀或吸附核酸， IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 沉淀或吸附核酸 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 材料准备基因组DNA的提取 基因组DNA的提取 DNA 最好使用新鲜材料， 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 时 提取血液基因组 选择有核细胞（白细胞） 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解 否则会造成 降解 含病毒的液体材料DNA含量较 含病毒的液体材料DNA含量较 DNA 少，提取前先富集 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA 使用处于对数期的新鲜菌体 老化菌体导致开环质粒增加） （老化菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力， 培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染， 菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒， 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒， 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失） 菌株不要频繁转接（质粒丢失） 细胞裂解基因组DNA的提取 基因组DNA的提取 DNA 材料应适量，过多会影响裂解， 材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 量少， 导致 量少 针对不同材料， 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 解预处理方式： 植物材料 液氮研磨 植物材料液氮研磨 动物组织 匀浆或液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 蛋白酶 组培细胞蛋白酶 细菌 溶菌酶破壁 细菌溶菌酶破壁 酵母 破壁酶或玻璃珠 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时， 高温温浴时，定时轻柔振荡 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA 菌体量适当 培养基去除干净， 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长（ 分钟 分钟）， 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长， 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染 有基因组 的污染 G菌、酵母质粒的提取，应先 酵母质粒的提取， 用酶法或机械法处理， 用酶法或机械法处理，以破壁 ? ? ? ? ? 核酸分离、 核酸分离、纯化基因组DNA的提取 基因组DNA的提取 DNA 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 时 采用吸附材料吸附的方式分离 供相应的缓冲体系 采用有机（ 氯仿 抽提时应充分混匀， 氯仿） 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔 离心分离两相时， 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点， 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法 核酸分离、 核酸分离、纯化蛋白质的去除： 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 核酸分离、 核酸分离、纯化多糖的去除： 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 1/2 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积) 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 (1/2体积 以与多糖的羟基作用， 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 代替乙醇沉淀DNA DNA： DNA液中加入 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 冰浴20min 20min。 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分离、 核酸分离、纯化多酚的去除： 多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、 巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 抗坏血酸、半胱氨酸、 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 加入易与酚类结合的试剂： PVP、PEG(聚乙二醇) 聚乙二醇 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA DNA的结合 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 盐离子的去除： 70 70的乙醇洗涤 核酸沉淀、 核酸沉淀、溶解基因组DNA的提取 基因组DNA的提取 DNA 质粒DNA的提取 质粒DNA的提取 DNA 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的 体积的NaOAc（pH5.2，3M），有 ），有 沉淀时加入 体积的 （ ， ）， 利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤， 沉淀后应用 的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 晾干 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 若长期储存建议使用 缓冲液溶解 ? ? TE中的 中的EDTA能螯和 2+或Mn2+离子，抑制 能螯和Mg 离子，抑制DNase 中的 能螯和 pH值为 ，可防止 值为8.0，可防止DNA发生酸解 值为 发生酸解 基因组DNA的检测 基因组DNA的检测提取的基因组DNA片段在 片段在20kb30kb之间 提取的基因组 片段在 之间 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 带型 高质量的基因组 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 ?g/ mL 双链 浓度及纯度的检测 双链DNA； ； A260/280 约为1.8 约为 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应。 样品不纯， PCR反应 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 1. 2. 3. 4. DNA中含有蛋白、多 DNA中含有蛋白、 中含有蛋白 糖、多酚类杂质 DNA在溶解前 在溶解前， DNA在溶解前，有酒 精残留， 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 DNA中残留有金属离 DNA中残留有金属离 子 RNA的存留 有RNA的存留 1. 对 策 2. 3. 4. 重新纯化DNA， 重新纯化DNA，过吸附 DNA 柱去除蛋白、多糖、 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质 重新沉淀DNA DNA， 重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70 70 增加70乙醇洗涤的 次数（ 次数（2-3次） 加入RNase降解RNA RNase降解 加入RNase降解RNA DNA提取常见问题 DNA提取常见问题问题二：DNA降解 降解。 问题二：DNA降解。 原 因 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 对 酶的活性 提取过程操作过于剧 策 DNA被机械打断 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 4. 5. 尽量取新鲜材料， 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后， 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 DNA时 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量， 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制， 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 DNA分装保存于缓冲液中 分装保存于缓冲液中， 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少 提取量少。 问题三：DNA提取量少。 原 因 1. 2. 3. 4. 1. 2. 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 吸附或沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 洗涤时DNA丢失 DNA 对 策 3. 4. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材 尽量选用新鲜（幼嫩） 料 动植物要匀浆研磨充分； 动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁。 或机械方式破壁。高温裂解 时，时间适当延长（对于动 时间适当延长（ 物细胞、细菌可增加PK PK的用 物细胞、细菌可增加PK的用 量）。 增加吸附的时间， 增加吸附的时间，或低温沉 淀 小心操作 RNA提取专题 RNA提取专题第一部分： 第一部分：RNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析 第二部分： 提取及常见问题分析 分离提纯RNA的目的 分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 RNA的不稳定性 RNA的不稳定性由于核糖残基的2和 位置带有羟基 位置带有羟基， 由于核糖残基的 和3位置带有羟基，RNA易 易 于被RNA酶切割水解 于被 酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复 酶含量丰富， 酶含量丰富 活性， 活性，不易失活 提取RNA的注意事项 提取RNA的注意事项经常更换新手套。 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。 ，会导致 污染。 污染 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 应使用不含 的塑料和玻璃器皿。 的塑料和玻璃器皿 150烘烤4小时，塑料器皿可在 烘烤 小时 塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡 小时， 中浸泡10 中浸泡 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 。 常用RNA酶抑制剂 常用RNA酶抑制剂焦磷酸二乙酯（ 焦磷酸二乙酯（DEPC）： 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结 ）： 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结 合使蛋白质变性，强烈但不彻底的 合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 。 酶抑制剂 异硫氰酸胍：目前是最有效的 酶抑制剂， 异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使 酶抑制剂 RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来， 酶失活 RNA酶有强烈的变性作用。 酶有强烈的变性作用。 酶有强烈的变性作用 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物， 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 酶的活性。 酶结合形成过渡态类物质 酶的活性 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来 酶的蛋白抑制剂（ ）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来 酶的蛋白抑制剂 ）： 的酸性糖蛋白。 酶的一种非竞争性抑制剂， 的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和 是 酶的一种非竞争性抑制剂 多种RNA酶结合，使其失活。 酶结合，使其失活。 多种 酶结合 其它： 酶也有一定抑制作用。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对 、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 酶也有一定抑制作用 RNA提取专题 RNA提取专题第一部分： 第一部分：RNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析 第二部分： 提取及常见问题分析 RNA提取的步骤 RNA提取的步骤材料的裂解异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇， 异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇， N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复 月桂肌氨酸 合物变性，释放RNA，有效抑制核酸 合物变性，释放 ， 酶。 苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物， 苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物， 及蛋白沉淀到有机相。 使DNA及蛋白沉淀到有机相。 及蛋白沉淀到有机相 杂质的去除 RNA的吸附或沉淀 的吸附或沉淀 硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 或用异丙醇沉淀浓缩 。 处理的水溶解RNA 经DEPC 处理的水溶解 材料准备及裂解 RNA的提取 的提取尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位， 尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位， 现取现提。 现取现提。 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清， 织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。 织选取杂质少的部位 细菌和酵母需要匀浆处理。 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻， 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入 专门的RNA样品储存液中保存。 样品储存液中保存。 专门的 样品储存液中保存 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充； 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻 底而迅速地匀浆。 底而迅速地匀浆。 杂质的抽提 RNA的提取 的提取采用有机（ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀 氯仿） 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、 DNA分布到中间层和有机相中 RNA留在水相中 分布到中间层和有机相中， DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层， 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶 剂抽提 RNA的沉淀和溶解 的沉淀和溶解 RNA的提取 的提取含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 RNA的水相过吸附柱， 的水相过吸附柱 等杂质 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集 RNA应充分的混匀并放置10min 沉淀，70乙醇洗涤， 沉淀，70乙醇洗涤，晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解 处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 用经 处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解 样品收集后或需长期保存时应置于 或加入RNase抑制剂， 抑制剂， 样品收集后或需长期保存时应置于70 或加入 抑制剂 分装使用 RNA的检测 的检测电泳槽系统的处理 乙二醛化琼脂糖凝胶电泳 含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳 RNA纯度及浓度的检测 纯度及浓度的检测（A260=1 ，约40 ?g/ mL RNA； ； 约为1.9-2.1 ） A260/A280 约为 RNA提取常见问题 提问题一： 问题一： RNA样品不纯 样品不纯 原因 1 保证彻底的裂解和一定 转数一定时间的离心； 转数一定时间的离心； 增加有机溶剂抽提的次 数，用吸附柱纯化 减少处理样品的量； 2 减少处理样品的量；加 入不含RNase的DNase处 入不含RNase的DNase处 RNase 理；再次纯化 3 增加漂洗次数 抽提过程不彻底存 在蛋白或多糖多酚 的污染 2 DNA 的污染 3 离子浓度较高 1 对 策 RNA提取常见问题 提问题二： 问题二： RNA得率低 得率低 原因 1 去除样品中的杂质，离 去除样品中的杂质， 心除净样品中的培养基 或储存液 减少样品用量； 2 减少样品用量；充分研 磨样品， 磨样品，增加裂解液的 用量和裂解的时间 3 延长吸附时间或保证异 丙醇沉淀的时间和离心 时间； 时间；再次洗脱 重复吸附， 4 重复吸附，加入肝糖等 有助RNA沉淀的试剂 有助RNA沉淀的试剂 RNA 1 样品含有杂质杂液 2 样品过量或样品裂解 和匀浆不彻底 RNA未有效的吸附沉 3 RNA未有效的吸附沉 淀或洗脱 样品RNA RNA含量少 4 样品RNA含量少 对 策 RNA提取常见问题 提问题三：RNA容易降解 问题三：RNA容易降解 原因 1 尽量取新鲜的样品； 尽量取新鲜的样品；取样 后立即放入液氮保存； 后立即放入液氮保存；或 放入专门的储存液内； 放入专门的储存液内；研 磨样品及时补充液氮 2 认真地处理相应的器具和 试剂； 试剂；严格地操作 冻存，分装使用； 3 -70 冻存，分装使用； 加入RNase RNase抑制剂 加入RNase抑制剂 样品不新鲜或样品 保存不当，RNA降解 保存不当，RNA降解 污染了RNase 2 污染了RNase 3 样品储存不当