EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书版本号:160120EASYspin Plus Plant RNA KitEASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒目录号：RN38v 适用范围：适用于快速提取植物组织细胞总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术可有效清除电泳可见gDNA残留，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR等。v 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次(RN3802)裂解液RLT室温50 ml裂解液CLB室温8 ml裂解液RLT Plus室温25 ml去蛋白液RW1室温40 ml漂洗液RW室温10 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-free H2O室温10 mlPLANTaid室温5 ml基因组DNA清除柱和收集管室温50套RNase-free吸附柱RA和收集管室温50套本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。储存事项：1. 不合适的储存于低温（4或者20）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（1525）进行。2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。v 注意事项1. 所有的离心步骤均可在室温完成（4离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。2. 需要自备乙醇，研钵(可选)。3. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。4. 裂解液RLT和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。5. 关于DNA 的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspin Plus RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup) ，请联系我们索取具体操作说明书。4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RN34)前可先索取具体操作说明书。6. 仔细阅读补充说明2，如果裂解液CLB效果好，可以联系我们单独订购裂解液CLB。以后可直接订购RN53 EASYspin Plus 多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒。v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）提示：ð 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!1. 直接研磨法（提取简单植物样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:a. 新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）RLT和1体积（100l） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。注：PLANTaid是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。b. 将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。c. 取480l裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。d. 立刻接操作步骤的步骤3。2. 液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法）:a. 取500l裂解液RLT，转入1.5ml离心管中，加入50l PLANTaid混匀备用。b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。c. 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。d. 将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。e. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀,不要离心。f. 立刻接操作步骤的步骤3。注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RLT和100l PLANTaid和100mg的样品。3. 将混合物(每次小于720l，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500l裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500l左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。5. 立刻将混合物(每次小于720l，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。6. 加700l 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。7. 加入500l漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500l漂洗液RW，重复一遍。8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50l RNase free water（事先在 70-90水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。10. 如果预期RNA产量>30g，加30-50l RNase free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1530%,但是浓度要低,用户根据需要选择。补充说明1：一般植物种类非常复杂，不同的植物种类和部位的样品使用本试剂盒（RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒）效果不同。部分的样品在经过基因组DNA清除柱清除残留DNA的同时可能会严重降低产量。该种情况下，建议客户可以尝试按照RN09 EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒的操作步骤进行提取。略去基因组DNA清除柱子的步骤。RN09和RN38相比少一个基因组DNA清除柱的步骤，部分情况下可能会提高产量。如果RN09提高产量的同时DNA残留也增多的情况下，客户可以根据实验需要加一个DNA酶柱上消化的步骤（货号：RN34）来清除残留DNA或者用传统的DNA酶消化来清除DNA残留。附录1：RN09 EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒操作步骤 RN09 EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒和RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒的操作完全相同，就是省略了步骤3和4，在步骤1和2后直接接步骤5。也可以找我们索取RN09 EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒详细说明书或者公司的 补充说明2：有一些特别复杂的样品使用裂解液RLT提取失败或者产量很低想提高产量的情况下，可以尝试使用裂解液CLB，裂解液CLB是本公司最新研发配方，测试的松针、丹参叶、胡杨叶、番茄叶表明可以提高产量一倍甚至数倍。附录2：RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒使用新裂解液CLB操作步骤ð 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!ð 取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解）， 在裂解液CLB中加入5% -巯基乙醇（1ml CLB加50l -巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。1. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。2. 转移100-150mg细粉（水分少的样品如种子叶片等可加100mg，水分多的样品如西瓜可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有ß-巯基乙醇）离心管中，立即激烈涡旋3060秒或者用吸头吹打混匀裂解，短时放回 65°C水浴中（5 min-10 min，时间稍长一点10分钟产量可能提高一些），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。ß-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。3. 振荡混匀后室温13,000rpm离心10分钟。4. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。5. 立刻接操作步骤的步骤3。附录3：使用RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒和RN09 EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒发表的部分文章已经超过130篇：1. 桃果实、花、根、叶：Isolation, characterisation and phylogenetic analysis of resistance gene    analogues in a wild species of peach (Prunus kansuensis).Canadian Journal of Plant Science,    2011, 91(6): 961-970 2. 樱桃花、叶、颚等各部位：Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium    L.)    causes early floweri.Journal of Plant Physiology, 2012,Available online 1 December    2012 3. 洋葱根、茎、蕾、叶、雌雄蕊等各部位：Cloning and Expression Analysis of A Putative B Class MADS-box    Gene of AcPI in Onion. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(23):4759-4769 4. 芜菁：Isolation and Functional Characterisation of the Genes Encoding 8-Sphingolipid       Desaturase from Brassica rapa. Journal of Genetics and Genomics Volume 39, Issue 1, January    2012,    Pages 4759 5. 芜 菁 1 ：EXPRESSION, DIVERGENCE AND EVOLUTION OF THE CALEOSIN GENE FAMILY IN BRASSICA RAPA. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 65 (3), 863-876, 2013 DOI:10.2298/ABS1303863H6. 番茄叶：Effect of Low Temperature Stress on the Expression of ProDH Gene and the Activities of the Proline Dehydrogenase in Leaves of Tomato Seedling. Chinese Agricultural Science  Bulletin 2012,28(10):132-135 7. 栀子叶：Isolation of High Quality Total RNA from Gardenia jasminoides Eills.Chinese Agricultural    Science Bulletin.2012, 28(27):194-198 8. 油桐果实：Cui Qinqin, Han Xiaojiao, Chen Yicun, Zhan Zhiyong, Lin Liyuan, Wang Yangdong.     Isolation and Expression Characteristics of Biotin Carboxyl Carrier Protein Coding Gene（VfBCCP)  from Vernicia fordii.SCIENTIA SILVAE SINICAE. 2012, 48(8): Available online August 9. 油桐果实1：Selection of Reliable Reference Genes for Gene Expression Studies Using Real-Time    PCR in Tung Tree during Seed Development. PLoS ONE, 2012, 7(8): e43084 10. 紫菜：Molecular cloning and expression analysis of ribosomal protein S7 gene from Porphyra    haitanensis. JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA, 2011, 35（12）：1814-1821 11. 石斛：Molecular characterization of a mitogen-activated protein kinase gene DoMPK1 in Dendrobium officinale. 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Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(7): 99-104 17. 五倍子：Cloning and characterisation of a phenylalanine ammonia-lyase gene from Rhus chinensis. Plant Cell Rep, 2013, published online：15 March, 2013 18. :五倍子1：Cloning, characterization and expression of chalcone synthase from medicinal plant Rhus chinensis.J. Plant Biochem. Biotechnol. DOI 10.1007/s13562-013-0231-919. 青杄 ：cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of the sPPa1 Gene form Picea wilsonii. Plant Science Journal, 2012, 30(40): 394-401 20. 青杄 1：cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of PsbO Gene from Picea wilsonii.Life Science Research, 2012, 16(3): 201-20621. 青杄 2：Cloning and Tissue Expression Analysis of PwPSAF in Picea wilsonii. SCIENTIA SILVAE SINICAE. Vol. 49，No. 10, Oct. 2013.22. 洋葱：Molecular Cloning and Transcriptional Analysis of the Putative AGAMOUS Homolog AcAG in Onion (Allium cepa. 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Phytopathology "First Look" paper http:/dx.doi.org/10.1094/PHYTO-01-13-0025-R posted 11/27/2013.38. 海棠：The Malus crabapple transcription factor McMYB10 regulatesanthocyanin biosynthesis during petal coloration. Scientia Horticulturae 166 (2014) 4249.39. 海藻：A rapid and sensitive method for field detection of Prorocentrum donghaiense using reverse transcription-coupled loop-mediated isothermal amplification. Harmful Algae 29 (2013) 3139.（篇幅有限，以下仅列出植物种类名称，发表文章全文可联系我们索取：40油茶，41亚洲百合，42毛泡桐，43人参,，44雪莲，45柑橘3，46菊花，47荞麦和拟南芥，48油松，49玫瑰花，50棉花和拟南芥，51棉花和拟南芥1，52白杨，53毛果杨，54葛根，55百合，56百合1，57黄鹌菜，58棉花1 ，59苹果，60毛果杨）.精品文档.