第五章 动物细胞制药.ppt

第 五 章动物细胞制药,第一节 概 述,细胞学说的建立组织培养和细胞培养细胞工程学,第二节动物细胞的形态和生理特点,一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞,贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型,悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,二、动物细胞的生理特点, 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M）,G1期：46h 合成DNA聚合酶 RNA合成S期：68h DNA合成G2期：25h DNA量加倍, RNA合成M期：0.51h 染色体分裂,细胞代数为细胞分裂次数传代数表示细胞培养分种传代次数细胞代数=传代数×分种数/2X=(logN-logNo)÷log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数倍增时间=培养经过时间÷代数,细胞生长需贴附于基质,并有接 触抑制现象。正常二倍体细胞的生长寿命是 有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系,动物细胞对周围环境十分 敏感; 对理化因素敏感，如： 渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。,动物细胞对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、 微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。,动物细胞蛋白质的合成途 径和修饰 功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体,游离核糖体合成蛋白质用于 细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋 白质是分泌的和膜中的整合 蛋白多为糖蛋白。,动物细胞生产药物缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。,第三节生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系,二、生产用动物细胞的获得,原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。,二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆， 从多种细胞成分的组织中，挑 选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。,二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；可传代培养50代；无致瘤性。,二倍体细胞,转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体， 失去正常细胞特点，而获得无 限增殖能力。转化过程可以是 自发的，和人工的，从肿瘤组 织中。,三、常用生产用动物细胞的特性,W1-38：正常胚肺组织人二倍体 细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞， 能产生胶原，培养基用BME （Eagle Basal medium）。,10%小牛血清，pH7.2,同工酶为G6PD B型。倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，用于制备疫苗。,MRC-5：从正常男性肺组织 中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。,有限寿命4246代。增殖 速度较W1-38快，对不良 环境敏感性较W1-38低。 对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。,CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。 核型： 2n=2022。 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。,BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。,用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。,Vero：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞， 核型2n=60；,培养基为199培养基， 加5%胎牛血清；用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、 狂犬病毒。,Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，1214条标记染 色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 干扰素。,SP2/0-Ag14：通过融合的方法， 从有羊抗红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，,能耐受8氮鸟嘌呤 20g/ml但 在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎 牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。,Sf-9 1983年从亲代IPLBSF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。,通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。,四、基因工程细胞构建和筛选,在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。,被用构建工程细胞的动 物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。,真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒质粒载体,牛痘病毒： 用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。 杆状病毒： 用于外源基因表达。,其作为载体的 优点： 双链DNA，易重组 插入78kb DNA不影响正 常病毒粒子的形成。,多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；,多角体蛋白基因有非常强的 启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质的20%30%；,用光学显微镜可看到多角体， 可以此作为标记物，选阳性克 隆。如用家蚕杆状病毒，还可在蚕 体表达外源基因。,质粒载体在细菌和哺乳动物细胞 体内都能扩增。都含有如下基本 成分： 允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。 含有使基因表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整 合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝 数的扩增系统。,基因载体的导入和高效表达工程细胞株 的筛选,基因载体导动物细胞 常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法,磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中， 形成DNA磷酸钙共沉淀物，当 和细胞表面接触时，则通过细胞 吞噬作用而将DNA导入。,电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。,五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞库 生产用细胞库,原始细胞库贮存时须有该细 胞的详细挡案，包括： 该细胞系的历史 该细胞系的特性 对各种有害因子的检查结果,生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单 一安瓶来，或从多个安瓶来 即刻混合，经培养扩增再分 装储存形成细胞库。,需建挡案， 进行无菌性无细胞交叉污 染的检查。 需确定最高使用的传代数。,