实验三 植物光合与呼吸速率的测定.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流实验三 植物光合与呼吸速率的测定.精品文档.实 验 植物光合与呼吸速率的测定红外线CO2吸收法一、实验目的光合作用是地球上最重要的生命现象，它是唯一能把太阳能转化为稳定的化学能贮藏在有机物中的过程，是维持地球上物质循环的关键环节，也是农作物产量形成的决定性因素。在植物科学研究中，经常需要测定光合作用。在光合作用（及呼吸作用）测定方法的发展过程中，曾经有过多次革新，其中包括测定干物质积累的称重法，测定CO2吸收（和释放）的滴定法，测氧气释放的检压法和氧电极法等。与这些方法相比，红外线气体分析仪堪称较先进的方法。它不但快速、准确，而且可将测定信号变为电信号输出，便于仪器的自动化和智能化。一、实验原理红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理：当红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯比尔定律。即红外线经过 CO 2气体分子时，其辐射能量减少，被吸收的红外线辐射能量的多少与该气体的吸收系数（ K ）、气体浓度（ C）和气体层的厚度（ L ）有关，可以用下式表示： E = E 0 e -KCL 式中： E 0：入射红外线的辐射能量； E：透过的红外线的辐射能量。一般红外线 CO 2 气体分析仪内设置仅让 4.26m 红外线通过的滤光片，其辐射能量即 E 0 ，只要测得透过的红外线辐射能量（ E ）的大小，即可知 CO 2 气体浓度。本实验中：IRGA 是测定 CO 2 浓度的专用仪器，不能直接测定植物叶片的光合速率，必须根据 IRGA的性能和测定目的，将 IRGA与同化室组成一定的气路系统，才能进行叶片光合速率的测定。常用的气路系统有密闭式和开放式两种（本实验采用密闭式）。 1、密闭式气路系统：被测植物或叶片密闭在同化室中，不与同化室外发生任何的气体交换，同化室内的 CO 2浓度因光合作用而下降，或由呼吸作用而上升，可用 IRGA 测定同化室内 CO 2 浓度的下降值或上升，计算光合速率或呼吸速率。二、仪器 GXH-3051红外线CO2气体分析仪气泵开关电源开关调零旋钮调零测量转换旋钮进气口出气口图3-3-1、GXH-3051红外线CO2气体分析仪闭路光合的工作原理为：由两根气路管在叶室和红外线CO2分析仪之间连通形成回路进行气体的循环，在叶片的光合作用吸收CO2放出O2的过程中达到对CO2浓度降低的测量，从而计算出植物光合作用速率等数据。原理图如下：显示与调节叶 室红外线分析仪气体输入气体输出光照图 闭路光合的工作原理图开路光合的工作原理为，由单根导气管在红外线CO2分析仪与叶室之间连通，形成开路。在开路光合测量时，通入的气体浓度必须是已知的（如P1=500ppm），当数据采集完成后，读出的数据（设为P2），那么由仪器读数在光合作用前后的变化值就是植物光合作用所吸收的CO2的量（设为P光合）。即： P光合=P1-P2开路光合的光合速率测定公式为：式中各字母代表的参数与闭路光合时一样，F代表气体流量。工作原理图如下稳定气源输入叶 室显示与调节红外线 分析仪气体输出光照图 开路光合测量工作原理图 三、实验材料甜菜和丁香等植物的叶片（活体）。四、实验步骤1、 按仪器使用说明书要求将气路系统的各部分连接起来，打开气室。2、 接通电源，打开红外仪电源预热15min，表头显示的数据为残留在样品室中的CO2的气体浓度值。预热过程中气泵开关应处在关闭的位置上。3、将仪器后面板的切换阀旋到左侧的调零位置上，打开气泵电源，约1min后，数显表头的显示值趋向零点附近，调节红外仪前面板“调零”旋钮，显示在“零点”位置。4、跨度校准：关上气泵的开关，将仪器后面板的切换阀旋到右侧的测量位置上，将标准气以1.2L/min的流量与仪器的“进气口”相连，使标准气通入仪器内，约1min左右，待显示值稳定以后，旋下跨度电位器上的保护盖，调节跨度旋钮使显示CO2浓度与标气浓度一致。5、 将待测叶片放入同化室（气室），密闭后当CO2浓度稳定下降时，开始测定，读取开始的CO2浓度值C1，开始计时，CO2下降至C2（约下降2030ppm），终止计时，记录C1、C2、t（或确定从测定开始到结束所需时间），测定结束后测量叶片的面积（气室面积）。6、 计算净光合速率：上式中，Pn光合速率（单位mol·m2·s1）；CCO2浓度落差C1-C2（ppm：uL/L）；t测定时间（S）；S叶片面积（单位m2）；V同化室（包括气路系统）体积（单位L：0.07L）；t同化室的温度；P大气压（单位Mpa）。系统容积是闭路光合中很重要的一项参数。它的值包括了叶室体积、气路管容积和红外线分析仪里气室容积的总合，即V系统容积=V叶室体积+V气路管容积+V分析仪气室容积该仪器的系统容积为0.07L。7、呼吸速率测定：叶室用遮光布（由红、白、黑布叠缝而成）遮光。方法同上。 表1-1 植物光合速率呼吸速率测定记录表植物材料叶片面积(m2)同化室体积V(L)同化室温度t ()大气压P (Mpa)测定时间t（S）CO2浓度落差C（ppm：uL/L）0.07L光合速率Pn（mol·m2·s1）呼吸速率（mol·m2·s1）五、注意事项1、密闭系统的最基本要求是严格密闭，不能漏气，否则无法测定。 2、红外仪的滤光效果并不十分理想，水蒸气是干扰测定的主要因素，因此，取样器干燥管内的 CaCl2要经常更换，避免吸水溶解进入红外仪，污染分析气室，以保证测量精度，延长仪器寿命。3、实验期间，仪器使用后请立即充电，以确保后续实验正常进行。实验四 植物体过氧化物酶的测定一、实验目的：掌握用愈创木酚法测定过氧化物酶活性的方法。二、实验原理：过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。三、实验材料、试剂与仪器设备1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液100 mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中。3、实验材料任何植物材料四、实验步骤1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/L KH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/L KH2PO4 5mL溶液提取一次，合并两次上清液。2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO4 1mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。五、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.g(鲜重)表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。 过氧化物酶活性u/(g.min)=式中：A470反应时间内吸光度的变化。 W植物鲜重，g。 VT 提取酶液总体积，mL。Vs 测定时取用酶液体积，mL。 t反应时间，min。六、思考题1、引起误差的原因。2、实验数据的分析和讨论。