生化技术原理期末考试复习重点(共14页).docx

精选优质文档-倾情为你奉上第一章1：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 2：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠分析测定方法，是制备生物大分子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。3：分析测定的方法主要有两类： 即生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。4：生物大分子的分离纯化方法有多种，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： 利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。 5：需了解的生物大分子物理、化学性质,主要有： 1、在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2、在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 3、固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4、各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 5、其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 6、对其他生物分子的特殊亲和力。6：为什么要细胞破碎细胞是生物体结构和功能的基本单位，通常人们所需的物质有些分泌于细胞外，如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌细胞外的培养液中，用通常的溶剂可自接提取；有些则存在于细胞内，这类酶又有游离酶和结合酶之分，前者游离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结合(如氧化还原酶和有机磷水解酶等)。欲提取存在于细胞内的物质时、必须把细胞破碎。细胞破碎的阻力跟细胞结构有关。7：纯化方案 是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法有机地互补联合、灵活应用的总称。它既是从各类材料中提取分离有效成分的前提，又是成功地达到纯化目的之保证。8：纯化方案的评价对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价，而这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出。其方法是，对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测定，并将各自的比活力(活力单位数/毫克蛋白)、纯化倍数(每步的比活力粗抽提液的比活力)和收得率计算出来。视纯化倍数的大小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值。一般认为，凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的，反之，则应用价值不大。实践中对纯化倍数和收得率的要求是依据材料来源的难易而变化的。若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数(见沉淀法)。9：蛋白质纯度的鉴别标准蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。蛋白质纯度的鉴别有下列几点要求： 蛋白质在不同pH条件下的电泳，均呈现一条分离区带。  蛋白质等电点聚焦电泳呈现一条分离带。  经纯化后的蛋白质，应不失其生物活性。  纯的蛋白质在超速离心力场中，以单一的沉降速度运动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。10：蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定是分离纯化工作中的重要部分。蛋白质测定的方法有： 紫外吸收法 利用芳香族氨基酸在280nm的吸收作用。  福林酚法（Folin法） 与福林试剂反应产生蓝色。 染料结合法（Bradford法）与考马斯亮蓝G-250反应产生蓝色。   固体样品中蛋白质含量的测定，一般用凯氏定氮法。11：核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。12：核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。13：蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。14：从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。15：核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。第二章1: 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。2: 硫酸铵盐析固体法盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）、计算法X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0 515，20 513 A为常数 0 0.27 20 0.29P2、P1为初始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）、查表法饱和溶液法V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)；V0表示原来溶剂的体积(m1)；S1和S2含义同上；S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。3：有机溶剂沉淀法的优点是： 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。4：有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法的注意事项在这里同样适用。此外，还有几点需要指出： (1)低温下操作：由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶剂预冷至一1O，而且整个操作要在低温下进行。 (2)中性盐作用：加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果。但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。因此，用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。 (3)多价阳离子作用：有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等)能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益第三章1：色谱法的优点和缺点 色谱法的优点分离效率高。几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。分析速度快。一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。检测灵敏度高。随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10-9g 级的微量物质。如采用预浓缩技术，检测下限可以达到 10-12g数量级。样品用量少。一次分析通常只需数纳升至数微升的溶液样品。选择性好。通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分物质。多组分同时分析。在很短的时间内（20min左右），可以实现几十种成分的同时分离与定量。易于自动化。现在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。色谱法的缺点定性能力较差。为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。 2：按层析过程的机理分类：分配层析：溶解度离子交换层析：带电性，静电引力吸附层析：吸附力亲和层析：配体专一性凝胶层析：分子大小3：按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。 4：吸附剂的选择 共性：吸附剂应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 个性：在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。否则反之。要选择一个理想的吸附剂必须经过多次试验才能获得。5：吸附剂的性质前处理：先过筛，除去大的颗粒，或者用悬浮法除去细小颗粒，然后用酸、碱等溶液浸泡，接着用沸水煮，清水洗，最后用有机溶液如甲醇处理，得到既无杂质、颗粒又均一的吸附剂。6：薄层层析有以下优点：1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需1560min；2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备；3温度变化和溶剂饱和程度对R值影响较小；4可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外)；5灵敏度高。 薄层层析的缺点:对生物高分子的分离效果不甚理想。7：薄层的几种类型不加粘合剂的薄层涂布法（1）氧化铝薄层 （2）纤维素薄层 （3）聚酰胺薄层 加粘合剂薄层的涂布法 硅胶G薄层 硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层特殊薄层 酸、碱薄层和pH缓冲薄层 络合薄层 8：薄层层析注意事项a吸附剂的颗粒均匀度和大小 b薄层要均一，厚度应适中。薄层厚度一般控制在0.25-0.5mm之间。 c加水量应视硅胶批号、来源而定。9： 如果薄层层析所用的支持剂是吸附剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附性质有如下规律：饱和碳氢化合物不易被吸附；不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈紧密；当碳氢化合物被一个功能基取代后，吸附性增大。吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶剂才能推动它。10：选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。一般而论，在同一种支持剂上，凡溶剂的极性愈大，则对同一性质的化合物的洗脱能力也愈大，即在薄层上能把此化合物推进得愈远，Rf值也愈大。如果用一种溶剂去展开某一成分，当发现它的Rf值太小时，可考虑换用一种极性较大的溶剂，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行层析。溶剂极性大小的次序是：石油醚<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水。11：TLC的通用显色方法   理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比。 在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得成尤为重要。通用显色法主要有：  （1）、紫外照射法：方便，不破坏样品； （2）、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；  （3）、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；   （4）、硫酸溶液：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。12：定性与定量分析定性通过薄层层析被分离的各种溶质组分在滤纸上移动的速率通常用Rf表示：    Rf组分移动的距离溶剂前沿移动的距离      原点至组分斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离。    在薄层、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下，各物质的Rf值是不变的，它不随溶剂移动距离的改变而变化。Rf与分配系数K的关系： Rf1(1+K)，a是由薄层性质决定的一个常数。由此可见，K值愈大，溶质分配于固定相的趋势愈大，而Rf值愈小；反之，K值愈小，则分配于流动相的趋势愈大，Rf值是定性分析的重要指标。13：薄层层析在定量分析时需注意以下几点    (1)在喷雾显色时，不加粘合剂的薄层要小心操作，以免吹散吸附剂。  (2)薄层层析还可以用强腐蚀性显色剂，如硫酸、硝酸、铬酸或其他混合溶液。这些显色剂几乎可以使所有的有机化合物转变为碳，如果支持剂是无机吸附剂，薄层板经此类显色剂喷雾后，被分离的有机物斑点即显示黑色。此类显色剂不适用于定量测定或制备用的薄层上。    (3)如果样品斑点本身在紫外光下不显荧光，可采用荧光薄层检测法，即在吸附剂中加入荧光物质，或在制备好的薄层上喷雾荧光物质，制成荧光薄层。这样在紫外光下薄层本身显示荧光，而样品斑点不显荧光。吸附剂中加入的荧光物质常用的有1.5硅酸锌镉粉，或在薄层上喷雾0.04荧光素钠、0.5硫酸奎宁醇溶液或1磺基水杨酸的丙酮溶液。(4)由于薄层边缘含水量不一致，薄层的厚度、溶剂展开距离的增大，均会影响Rf值，因此在鉴定样品的某一成分时，应用已知标准样作对照。  (5)定量时，可对斑点作光密度测定；也可将一个斑点显色，而将与其相同Rf值的另一未显色斑点从薄层板上连同吸附剂一起刮下，然后用适当的溶剂将被分离的物质从吸附剂上洗脱下来，进行定量测定。第五章1：离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。 离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。2：影响离子交换选择性的因素水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性影响亦大。离子强度：越低越好；有机溶剂：不利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；3：影响交换速度的因素颗粒大小：愈小越快交联度：交联度小，交换速度快温度：越高越快,与扩散系数增加有关离子化合价：化合价越高，扩散速度小离子大小：越小越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快4：离子交换层析的基本原理若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。+图5-2 P655：离子交换剂性质：1 2 4书P72 3膨胀度（吸水量） 膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时 间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。 影响膨胀度的因素有： （1）、基质 （2）、电荷基团 （3）、离子强度和pH值6：选择离子交换剂的一般原则如下： (1) 阴、阳离子交换剂选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。 (2) 强、弱离子交换剂选择 强型离子交换剂适用的pH范围很广，常用来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。弱型离子交换剂适用pH范围狭窄，在pH为中性的溶液中交换容量高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。(3) 不同离子型交换剂的选择 离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。 另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。 (4) 不同基质离子交换剂的选择 交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。7：生化用离子交换剂的特点1、亲水性和生物相容性2、孔结构3、电荷密度4、粒度5、纯度8：生化用离子交换剂的种类 生化专用离子交换剂 1、纤维素类 2、葡聚糖系Sephadex离子交换剂 琼脂糖系离子交换剂等。第七章1：亲和层析原理生物亲和作用：生物物质具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性（能区分结构和性质非常相近的其它分子）。 亲和层析是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和吸附介质：基质+配体 P114图2：亲和作用的机理1、结构特点（必要条件）：存在凹陷和凸起结构（钥匙和锁孔的关系）2、相互作用力的存在静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键3: 影响亲和作用的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失4: 亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。5: 配体的选择配体与待分离的物质有适当的亲和力。 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落， 配体自身应具有较好的稳定性，6：1活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 （1）、溴化腈活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。(2)、环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的NC、OC 和SC 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。7：特异性洗脱方法的优点： 特异性强，分辨率高；洗脱条件温和，大分子物质不容易变性。缺点： 平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件；价格昂贵。第九章1：HPLC有以下特点：高压压力可达150-300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速流速为0.1-10.0 ml/min。高效可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。2：HPLC与经典液相色谱相比有以下 优点：速度快通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。其 缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。4：仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。5：高效液相色谱分析方法的一般步骤通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 6：化学键合固定相 将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性键合相的种类 化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。 反相键合相色谱：常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。 正相键合相色谱常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1-C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广7：选择流动相时应考虑以下几个方面：动相应不改变填料的任何性质。纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。粘度要低（应<2cp）。对样品的溶解度要适宜。样品易于回收。应选用挥发性溶剂。8: 流动相的选择 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185-205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。9流动相的脱气HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。10: 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出第十二章1：基本概念： 重组DNA又称DNA克隆、分子克隆、有时也称基因克隆。重组DNA是指遗传信息按人的需要，将一种生物的基因或化学合成的基因，掺入载体，运送到另一种宿主细胞，通过载体的复制，可得到外源DNA或基因的无性繁殖和大量相应的基因产物。最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。 重组DNA操作是基因工程的核心。2：基因工程在植物上的应用 （1）基因工程改良作物的优越性：打破了周期长、效率低的缺限；打破种间隔离障碍；按人们意愿改造。 （2）基因工程改良作物：基因工程在动物上的应用 转基因在动物上：转基因鼠、转基因牛、转基因猪、转基因猴、转基因兔、转基因羊。基因工程的人类基因治疗 发酵工业 理论研究3： 重组DNA的主要步骤：1、分离目的基因（DNA片段）；2、选择或构建载体；3、连接目的基因与载体；4、重组DNA导入宿主细胞和外源基因表达等4：限制性内切酶 定义 是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在中使用的多数是后一类酶。 限制性内切酶可分为三大类型： 类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。 类型II ： 是DNA重组技术最为常用的工具酶。类型II 限制性内切酶的特点 识别位点严格专一 识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp(base pair ) 识别位点经常是一种回文序列的DNA限制性内切酶的切割方式就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种: 在对称轴5' 侧切割产生5' 粘端 在对称轴3' 侧切割产生3' 粘端 在对称轴处切割产生平段5：DNA聚合酶在体外合成系统中以DNA为模板，催化单核苷酸重新合成一条与模板互补的DNA序列。有以下几类： (1)DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)：DNA聚合酶I具有53聚合酶活性，35外切核酸酶活性和53外切核酸酶活性。 53聚合酶活性是能以单链DNA为模板，催化脱氧核苷酸底物合成与模板互补的DNA序列。而3 5外切酶活性则是能够除去延长的核苷酸链上的3OH末端上的脱氧核苷酸。 鉴于DNA聚合酶I大片段具有上述两种催化活性，它可用于补齐限制性内切核酸酶切割产生的3凹端，以及标记DNA片段的末端。Klenow酶作用a、用于同位素标记DNA片段末端b、合成cDNA的第二条链c、Sanger双脱氧法进行序列分析d、定位突变6：核酸酶 S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而产生平端；打开cDNA中发夹结构，使其成平端。 核糖核酸酶（RNaseA)：在质粒提取时降解RNA；从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。7：载体 P211质粒的生物学基本特性自主复制性：不相容性：稳定性：寄生性：表现型：质粒复制类型 严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制。每个细胞拷贝数仅12个。 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。每个细胞拷贝数甚至可高达数百个。8：质粒DNA的构型 SC构型:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 oc构型:两条链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现缺口，称之为开环DNA。 L构型:DNA的双链均发生断裂而形成线性分子。9：噬箘体 P21210：真核病毒P21311：构建文库的操作主要有下列4个步骤：制备DNA片段DNA片段与载体的连接重组体转化与克隆 筛选鉴定基因组12：重组DNA重组是指目的基因与载体DNA分子进行重新组合过程的简称。 连接DNA片段的方法有：黏性末端连接法、平端连接法、平黏连接法、T-A连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法等。13：选择性标记基因 P22514分析基因的结构与产物 P225第十五章第十八章 1：电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。电泳分离：利用荷电的溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。2：聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3273：电渗 P364专心-专注-专业