利用酵母双杂交系统筛选油菜ATP6的相互作用因子(共15页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上收稿日期 :基金项目 :国家自然科学基金 (作者简介 :岳渝飞 (1985- , 男 , 四川大学生命学院 2003级本科生 . 通讯作者 :杨毅 . E 2mail :yangyi528vip.sina. com文章编号 : (2007 利用酵母双杂交系统筛选油菜A TP6的相互作用因子岳渝飞 , 刘志斌 , 王健美 , 向俊蓓 , (, 摘 要 :(B . , 线粒体 A TP 合成酶的一个亚基 A TP6与 . A TP6作为诱饵蛋白 , 应用酵母双杂交共转化的方法筛选与 A TP6相互作用的蛋白质 . 在获得的阳性克隆中 , 发现了一个与拟南芥中未知基因 A T 3G 47550所编 码的蛋白质具有较高同源性的蛋白质 . 它含有 RIN G HC 的结构 , 可能在泛素 2蛋白质降解途径 与细胞质雄性不育间建立起了某种联系 .关键词 :酵母双杂交 ; 细胞质雄性不育 ;A TP6;RIN G 指结构 ; 泛素 2蛋白降解途径 中图分类号 :Q81 文献标识码 :AIdentif ication of the interacting partners of ATP 6in Brassica napusby using the yeast t wo 2hybrid systemY U E Y u 2f ei , L IU Zhi 2bi n , W A N G Jian 2mei , X IA N G J un 2bei ,W A N G Y an , L I X u 2f eng , YA N G Yi(K ey Labratory of Bio 2Resources and Eco 2environment of Ministry of Education ,College of Life Science ,Sichuan University ,Chengdu ,China Abstract :The cytoplasmic male sterile (CMS line of B rassica napus pol . is of great research utility among the rapeseed sterile lines. Researches of its molecular mechanism has substantiated that A TP6,subunit of the A TP synthase ,is related with CMS. By using of yeast two hybrid system ,A TP6was chosen as bait protein to screen its interacting partners. A fragment ,which has high identity with an unknown gene from A rabi dopsisthaliana (A T 3G 47550 ,was therefore found. The gene fragment has the structure of RIN G HC ,which sug 2gests its possible function between ubiquitin 2proteasome pathway and CMS. This paper would further the dis 2cussion.K ey w ords :yeast two hybrid (Y2H ,cytoplasmic male sterility (CMS , A T P 6,RIN G finger ,ubiquitin 2pro 2teasome pathway1 引 言植物花粉败育的现象称为雄性不育 . 根据遗传特点可分为核基因控制的核不育和细胞质遗传因素控制的细胞质不育 (Cytoplasmic Male Sterity , CMS . CMS 植株长有缺陷的雄花 , 但雌花器官正2007年 8月 第 44卷第 4期 四川大学学报 (自然科学版 Journal of Sichuan University (Natural Science Edition Aug. 2007Vol. 44 No. 4常 , 营养体部分也没有缺陷 , 它不能产生可育花粉 , 并且与正常花相比其结构发生了重大改变 . 油菜 CMS 类型根据细胞质来源可分为两类 , 一类是植 物自然繁殖过程中因突变或品种间杂交产生的 ; 另 一类是通过种属间远缘杂交或原生质体融合而又 核置换引起的 . 波利马 (Polima 胞质不育系 (Pol. 属于前一种类型 . 根据目前分子水平的研究 , 越来 越 多 的 证 据 表 明 , 线 粒 体 DNA (mitochondrial DNA , mtDNA 及 其 表 达 产 物 与 直 关 1. 早期关于质基因 (, 这 就表明线粒体基因是与 CMS 相关的 2. 线粒体 DNA 对于 CMS 的影响 :一是致使植株呼吸效率降 低 ; 二是会导致花型的改变和花粉结构的缺陷 . 其 中前者是主要影响 . 有一种假定认为是 CMS 基因 致使线粒体功能受到削弱从而无法满足花及花粉 形成过程中某些途径较高的能量需求和特殊的代 谢需求 , 其他组织并没受到影响是因为它们并不需 要如此高的线粒体活性 , 或者是因为 CMS 基因仅 仅在雄花器官的发育过程中高效的表达 3. A T P 6是线粒体 A TP 合成酶的一个亚基 , 其对能量代谢 的影响可能是导致花粉败育的一个重要原因 . Homme 和 Brown 认为 , A T P 6基因是 CMS 敏感部 位 4. 线粒体 A T P 6转录本的编辑在一种 CMS 高 粱的雄性器官中 (非幼苗中 大大降低 5. A T P 6基 因的 编 辑 发 生 改 变 与 水 稻 中 的 CMS 相 关 6. A T P 6的 RNA 编辑发生改变与编码区域发生点突 变的结果类似 , 都会导致严重的人类疾病 . 在油菜 Pol. 中与 CMS 相关的 mtDNA 位点为 O R F 224/ A T P 67. 对甘蓝型油菜体细胞杂种的分析表明 , Pol. CMS 胞质不育的杂种后代都含有 O R F 224/ A T P 6基因座位 , 这一基因座位与 Pol. CMS 性状 是高度连锁的 8. 在 Pol. CMS 系中 , O R F 224与 A T P 6两者 “共转录 (cotranscribe ” 产生 2. 2、 1. 9和 1. 1kb 的 3个 mRNA 转录本 , 而正常可育胞质 只产生 1个 A T P 6转录本 . 育性恢复基因可增加 1. 1kb mRNA 转录本的量 , 2和 1. 9kb 1. 4和 3.A T P 6作为 , cDNA 文库 , 发现与 A T P 6相互作用的蛋白质 , 进而深入 探索 A T P 6及其相关基因的功能 , 以期为 CMS 找 到注解 .2 实验材料与方法2. 1 实验材料AH109酵母菌株 、 p G B KT7253、 p G AD T72REC 载体 、 p G B KT7载体 、 甘蓝型油菜 “波里马” 细胞质 雄性不育系的恢复系 幼叶和鲑鱼精担体 DNA , 酵 母 培 养 用 的 YPD Medium 、 SD Minimal medium 、 2Trp DO Supplement 、 2Leu DO Supple 2 ment 、 2Leu/2Trp DO Supplement 、 2Leu/2Trp/2His DO Supplement 、 2Ade/2His/2Leu/Trp DO Supple 2 ment 均购自 CLON TECH. 硫酸腺嘌呤 (Adenine hemisulfate 购自 G ibco ; PEG 3250和 I yticase 购自 Sigma ;DMSO 购自 AMRESCO ; DH5大肠埃希菌 菌株 、 X 2G al 、 PCR 用的试剂及 T4DNA 连接酶购自 Takara 公司 . 其他常规分子生物学试剂购自成都 博瑞克生物技术公司 .2. 2 方 法2. 2. 1 目的基因扩增及诱饵载体的构建 根据 NCB I 上已发表的甘蓝型油菜 A T P 6序列设计一 对引物 Sense :52CTA TG AA TCAAA TA GGGCTGGT 23 B am H Antisense :52AA AA TGG A G A TTTA TA GCA TCA TTC 23 Pst 利用 CTAB 法提取油菜总 DNA , 使用上述引 物和模板扩增基因 A T P 6. PCR 反应条件是 94 2min ;94 30,57 30,72 1min , 共 35个循 环 ;72 延伸 10min ,8 10min.胶回收 PCR 产物 . 用 B am H 和 Pst 酶切 扩增到的 A T P 6和克隆载体 p G B KT7, 利用胶回 收试剂盒回收大 、 小片断 . T4DNA 连接酶连接大 小片断 , 并转化大肠杆菌 DH5.2. 2. 2 ds cDNA 文库构建 取甘蓝型油菜 “波里 马” 细胞质雄性不育系的恢复系 幼叶按 照张年辉等的方法提取总 RNA 10, 其浓度为 4. 9 329第 4期 岳渝飞等 :利用酵母双杂交系统筛选油菜 A T P 6的相互作用因子 ×10-6g/L , OD 260:OD280=2. 125. 双链 cDNA 合 成完全按照 CLON TECH 的 “ BD Mactmaker TM Li 2 brary Construction &Screening K its ” 用户手册进 行 , 之后使用 BD CHROMA SPIN 纯化产物 . 2. 2. 3 酵母细胞转化及阳性克隆筛选 下述步骤 完全按照 CLON TECH 提供的方法 . 从 DH5中抽 提质粒 p G B KT72A TP6, 利用 PEG /LiAc 法转化酵 母细胞 AH109细胞 , SD/2Trp 缺陷培养基 30 培 养 4d. 挑单克隆于液氮中冷冻后 Z中孵育 8h , p G 2和 G B KT72Lam 载体的 YH109菌 株 作 感 受 态 细 胞 , 将 ds cDNA 和 p G AD T 2Rec 共 转 化 已 含 有 p G B T72A TP6的 AH109感受态细胞 . 同时设立正对照 :SV40Large T PCR Fragment 和 p G AD T72Recp G B KT7253共转 化携带 p G B KT7253的菌株形成 AH109pG AD T72 Rec T +p G B KT7253; 负对照 :AH109p G AD T72 Rec T +p G B KT72Lam .转化了的酵母细胞在选择 性平板培养基 SD/2Leu/2Trp/2His 上培养 410 d , 能生长起来的即是一些候选 His3阳性克隆 . 再 将这些候选阳性克隆在 SD/ Ade/2Leu/2Trp/2His 平板上 30 培养 38d , 之后用滤纸印迹法来检 测菌落中 L acZ 报告基因的表达 (2半乳糖苷酶活 性 , 以剔除部分假阳性克隆 . 然后提取阳性克隆质 粒 , 转化大肠杆菌 DH5, 在含 Amp 的 LB 平板培 养 , 能生长的即含阳性 AD 克隆质粒 . 提取质粒 . 质 粒 PCR 检测以合并重复片断 , 分别使用 Taq 和 Bsu R1酶切剔除相同片断 . 挑菌 , 液体 LB +Amp 扩大培养 , 送公司测序 .2. 3 生物信息学初步分析将测序结果在 NCB I 上进行蛋白和氨基酸比 对 , 寻找同源序列 , 预测基因功能 , 为克隆基因全长 及其深入研究打下基础 .3 实验结果3. 1 构建 A TP62BD 诱饵酵母菌株利用 PCR 法扩增得到的油菜 Pol. A T P 6基因 (图 1 , 除去两端酶切位点和保护碱基 , 共 786个 碱基 , 同 NCB I 上注册的序列完全一致 . 成功构建 了 p G B KT72A TP6载体 (图 2 , 并转入酵母细胞 AH109, 在选择性平板培养基 SD/2Trp 筛选获得携 带 p G B KT72A TP6诱饵载体的 AH109, 菌落表面 有光泽 , 呈丘状隆起 , 表明 A TP6对酵母无毒性 ; AH109(p G B KT72A TP6 单克隆经液氮处理后 , 在 Z 缓 冲 液 /X 2gal 中 孵 育 8h 颜 色 不 变 蓝 , 说 明 A TP6蛋白无自发激活 L acZ 报告基因的能力 .图 1 PCR 扩增得到的含两端分别含 B am H 、 Pst 酶 切位点和保护碱基的 A T P 6基团Fig. 1 The complete A T P 6coded sequence with B am H 、 Pst restriction sites and protection bases on the temini图 2 使用 B am H 和 Pst 双酶切 p G B KT72A TP6载 体得到的电泳图Fig. 2 Agarose electrophoresis analysis of vector p G B KT72 A T P 6digested by B am H and Pst after A T P 6fragmenthas been subcloned into p G B KT7 vector3. 2 利用共转化筛选了甘蓝型油菜 cDNA 经共转化得到的酵母阳性克隆共 1087个 (图 3为多个长出菌落的 SD/2Ade/2His/2Leu/2Trp 平 板中的一个 , 使用滤纸印迹法菌落检测 L acZ 报 告基因的表达 ,8h 内变蓝的有 797个 , 其中包括正 对照 ; 负对照 8h 内不变蓝 . 图 4为其中一张滤纸 X 2gal 显色检测的结果 .429四川大学学报 (自然科学版 第 44卷 图 3 在 SD/2Ade/2His/2Leu/2隆Fig. 3con SD/2Ade/His/2图 4 L ocZ 报告基因表达分析Fig. 4 Expression analysis of L acZ reportergene filter assay图左上方正对照显示为蓝色 , 负对照不显色 , 其余显色为蓝色的是筛选到的阳性克隆3. 3 阳性克隆插入片断 PCR 检测按照 p G AD T72REC 插入片断两端的 SMAR T 位 点 和 CDS 位 点 分 别 设 计 上 游 引 物 (52CT ATTCG ATG ATG AAG AT ACCCCACCAAACCC 23 和下游引物 (52GTG AACTTG CG GGGTTTTTCAG 2T ATCT AG AT 23 , 按照程序 :94 2min ;94 30s ,64 30s ,72 2min , 共 35个循环 ;72 延伸 10min ,8 10min. 并以阳性克隆 p G AD T72REC质粒为模板进行 PCR (图 4为检测结果的一个部分 , 以合并重复片断 , 分别使用 Taq 和 Bsu R 酶切剔除相同片断 . 最后总共得到 122个大于 500bp 的不同大小的基因片断 , 图 5为其中的一部分 .5p G ADT72Rec 阳性克隆 PCR 质粒检测的部分结果Fig. 5 Agarose electrophoresis analysis of positivep G ADT72Rec clonesThe second band from lower to upper of Marker stands for 500bp3. 4 测序结果及序列分析将筛选到的基因片断放到 NCB I 上进行核酸 和氨基酸比对 , 发现油菜中一个含有 RIN G 指结构 的蛋白与 A T P 6有相互作用 , 其编码区同拟南芥 未命名基因 A T 3G 47550有较高的同源性 .4 结 语锌指蛋白是基于它的结构特征而得名 , 在锌指 蛋白中 , 几个保守的氨基酸 (通常为 Cys 与 His 与 一个 Zn 结合 , 形成一个称为锌指的相对独立的功 能区域 . 锌指蛋白往往具有不止一个锌指结构 , 它 广泛分布在动植物和微生物中 , 从酵母到人体 , 常 作为重要的转录调控因子参与在基因的表达调控 、 细胞分化 、 胚胎发育等许多生命过程 .而最近几年关于 RIN G 指的研究成为该领域 的一个热点 .本次实验筛选得到的序列中 , 得到了一个 651bp 的含有 C 3HC 4结构的 RIN G 指 (RIN G HC 蛋 白编码序列 , 下面是该序列与拟南芥未命名基因编 码蛋白 A T3G 47550在 NCB I 上的氨基酸比对结 果 . RIN G 指是一个小的锌结合结构域 , 不同于普通的锌指结构 , 它能通过独特的 “交叉带”(cross brace 结合两个锌原子 , 常见于复合蛋白质络合物 的亚基 . 具有 RIN G 指结构的蛋白质往往同时具有 与蛋白质和 DNA 结合的能力 11. 而目前发现的具有 C3HC4结构的蛋白质大多具有泛素 2蛋白质连 接 酶 (ubiquitin 2protein ligases , E3s 活 性 . 含 有 RIN G 指结构域的 E3s 可分为几个亚类 :单亚基 RIN G E3s (single subunit RIN G E3s 、 后期促进复 合物 (anaphase 2promoting complex ,APC 、 SCF 型529第 4期 岳渝飞等 :利用酵母双杂交系统筛选油菜 A T P 6的相互作用因子 E3s 和 VCB 2CUL2复合物 (VBC . 其中后三个亚 类都已在植物中发现 12. 泛素蛋白降解系统可以 调控许多重要过程 , 如细胞循环 、 信号传导 、 基因 转录 、 胞吞作用以及免疫反应 、 雄性不育和细胞程 序化死亡等 13,14.目前 , 对 SCF 型 E3s 的研究最为详尽 . SCF E3s 包含 4个亚基 :负责与蛋白底物结合的 F 2box 蛋白 (FBP 、 SKP1(S 2phase kinase. associated pro 2 tein 1, 拟 南 芥 中 为 ASK1 、 RIN G 蛋ROC1/HR T1和,是必需的 16. , 戴良英等人利用酵母双杂交证 实了 ASK1与 F 2box 蛋白 COI1发生相互作用并在 植物体内形成蛋白复合体 , 然后利用反义 RNA 策 略进行功能分析证明了 ASK1调控植物的雄性不 育 17. 成建红等最近在一些配子体型自交不亲和 植物 S 2RNase 基因近旁相继发现了一类花粉特异 性表达的 F 2box 基因 , 从而预示泛素介导的 SCF 蛋 白 降 解 途 径 可 能 参 与 配 子 体 自 交 不 亲 和 反 应 18.由于目前植物克隆的 RIN G 指蛋白还很少 , 还 无法对其功能得到较完整的阐释 . 但结合 RIN G 指 蛋白参与的泛素 -蛋白降解途径在生物体内广泛 的作 用 , 特 别 是 该 途 径 在 氧 化 压 力 (可 能 涉 及 A TP6相关的呼吸途径 以及细胞内异常蛋白积聚 (CMS 导致胞内异常蛋白增多 时所表现出的作 用 , 继续就本次实验筛选出的这一基因片段做深入 研究 , 对于揭示油菜 Pol. CMS 会是项很有意义的 工作 .参考文献 :1 Budar F , Touzet P ,de Paepe R. The nucleo 2mitochon 2 drial conflict in cytoplasmic male sterilities revisited J. G enetica ,2003,117:3.2 Boerner T. Male fertility of chloroplast 2ribosome defi 2 cient plants J.Biol Zbl ,1985,104:641.3 Conley C A , Hanson M R. Tissue 2specific protein ex 2 pression in plant mitochondria J.The Plant Cell , 1994,6:85.4 L Homme Y ,Brown G G. 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