生物学酶促反应动力学辅导学习PPT教案.pptx

研究酶促反应动力学的意义研究酶促反应动力学的意义 酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响酶反应速率的各种因素的科学。在研究酶的结构响酶反应速率的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提与功能的关系以及酶的作用机制时，需要动力学提供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最供实验证据；为发挥酶催化反应的高效率，寻找最有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些有利的反应条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规药物的作用机制等，都需要掌握酶促反应速率的规律。律。 二、底物浓度对酶反应速二、底物浓度对酶反应速率的影响率的影响酶反应速率对底物浓度作图酶反应速率对底物浓度作图中间复合物学说中间复合物学说 为了解释这个现象，为了解释这个现象，Henri和和Wurtz提出了提出了酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式表示：式表示： S + E ES P + E 酶底物中间复合物存在的证据酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复光衍射直接观察到酶与底物的复合物。合物。酶与底物结合后光谱发生变化。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。分离到了酶底物复合物。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。现象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同同( (半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧物浓度高于无酶一侧) )。 （1 1）平衡学说）平衡学说（Henri，Michaelis和和Menten方程）方程） 1902年年Henri和和Brown提出了酶催化的反应提出了酶催化的反应机理机理 1913年年Michaelis和和Menten完善了这个理论，完善了这个理论，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，他们认为酶反应的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。第二步慢，为限速反应。平衡学说推导反应速度方平衡学说推导反应速度方程的假设前提程的假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设：在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步迅速平衡，第二步慢，即第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以酶以E和和ES两种状态存在。两种状态存在。 平衡法推导出的米氏方程平衡法推导出的米氏方程其中其中SKSVVsm 米氏方程是一个双曲线方程，若以米氏方程是一个双曲线方程，若以S为自变为自变量，量，V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。结果相符。 12kkKs（2 2）稳态理论）稳态理论 1925年，年，Briggs和和Haldane提出了稳态（提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正： 在在 反应式中，反应式中，k3值值不小，后一步骤不是限速步骤。不小，后一步骤不是限速步骤。 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然酶底物复合物浓度由零逐渐增加到一定数值，然后保持不变，即处于稳态水平，后保持不变，即处于稳态水平，此时此时ES的解离和分的解离和分解速率之和等于解速率之和等于ES的形成速率的形成速率，稳态法推导出的米氏方程稳态法推导出的米氏方程其中其中SKSVVmm123kkkKm两个米氏方程的区别两个米氏方程的区别 这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是程中米氏常数是Ks，而稳态法推导的米氏方程中米，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是氏常数是Km。 12kkKs 132kkkKmKs是是 ES 的解离平衡常数。当的解离平衡常数。当 时，时， 转化转化成成 。23kk mKSK米氏方程的几个特点米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：从米氏方程中可以看出：当当S Km时，时， ，反应速率达到，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当当S = Km时，时， ，所以，所以，Km的意的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。物浓度。mmKSVVmmVSSVV22mmVSSVV米氏方程曲线米氏方程曲线米氏常数的意义米氏常数的意义 Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反应条件下，对于一定的底物，一定的反应条件下，对于一定的底物，Km是定值。是定值。 Km可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于可以判断酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中几个底物，其中Km最小的底物是天然底物。最小的底物是天然底物。 当当k3 k2时，时，Km = Ks，可以作为判断酶与底物，可以作为判断酶与底物亲和力的指标，亲和力的指标，Km越小，酶越小，酶与底物的亲和力越大。与底物的亲和力越大。多底物的酶促反应多底物的酶促反应（酶促反应按底物分子数的分类酶促反应按底物分子数的分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + BX AX + B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B + ATP AB + AMP + PPi6%三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用 因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力下降或丧失称为而因为某种物质与酶结合使酶活力下降或丧失称为酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有酶的抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变 性 。 能 抑 制 酶 活 力 的 物 质 称 为 酶 的 抑 制 剂变 性 。 能 抑 制 酶 活 力 的 物 质 称 为 酶 的 抑 制 剂（inhibitor）。）。 研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶研究酶的抑制作用是研究酶的结构和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可的催化机制，以及阐明代谢途径的基本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依以为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。据。抑制程度的表示方法抑制程度的表示方法%100)1 (%100)1 (%0VVaii（1）相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）（2）相对活力百分数（残余活力百分数）相对活力百分数（残余活力百分数）（3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）（4）抑制百分数）抑制百分数0VVai%100%0VVai011VVaii抑制作用的类型抑制作用的类型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。去除而使酶恢复活力。可逆抑制作用的可逆抑制作用的3种类型种类型（1）竞争性抑制（）竞争性抑制（competitive inhibition） I 和和 S 竞争与酶的活性中心结合，二者只能竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。竞争性抑制剂举例竞争性抑制剂举例可逆抑制作用的可逆抑制作用的3种类型种类型（2 2）非竞争性抑制（）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） I 与与 S 可以分别与酶结合，谁先结合都可以，可以分别与酶结合，谁先结合都可以，形成形成 ESI 三元复合物，但三元复合物，但 ESI 中的中的 S 不能转变成不能转变成产物。这类产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。结合。竞争性和非竞争性抑制剂竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理的抑制机理可逆抑制作用的可逆抑制作用的3种类型种类型（3）反竞争性抑制剂（）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition） I 只与只与 ES 结合，只有结合，只有 ES 能分解出产物，能分解出产物，ESI 中中的的 S 不能转变成产物。由于不能转变成产物。由于 I 的存在促进了的存在促进了E和和S的的结合，所以称为反竞争性抑制。结合，所以称为反竞争性抑制。 ES + I ESI P + E + I一些重要的不可逆抑制一些重要的不可逆抑制剂剂 （1 1）非专一性不可逆抑制剂）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 重金属盐重金属盐 烷化试剂烷化试剂 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和CO 青霉素青霉素（2 2）专一性不可逆抑制剂）专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 四、温度对酶反应的影响四、温度对酶反应的影响 在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的在较低温度范围内，酶反应速率随着温度的升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变升高而增加，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来性失活，反应速率反而下降。所以对于酶反应来说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞说，有一个最适反应温度。一般来说，动物细胞内酶的最适反应温度在内酶的最适反应温度在3540，植物细胞中的，植物细胞中的酶可达酶可达4050，也有一些生长在堆肥、温泉中，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生物酶的最适温度更高，如的微生物酶的最适温度更高，如Taq DNA聚合酶聚合酶的最适温度可高达的最适温度可高达70。 需要注意的是，最适温度需要注意的是，最适温度值不是酶的特征性值不是酶的特征性常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。温度对酶反应速率的影响温度对酶反应速率的影响五、五、pH对酶反应的影响对酶反应的影响 酶的活力受环境酶的活力受环境pH的影响，存在一个最适的影响，存在一个最适反应反应pH。酶的最适反应。酶的最适反应pH也不是一个特征性常也不是一个特征性常数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变。浓度的不同而改变。4种酶的种酶的pH-酶活性曲线酶活性曲线胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胆碱酯酶胰蛋白酶胰蛋白酶pH影响酶活力的原因影响酶活力的原因pH影响酶活力的原因有以下几方面：影响酶活力的原因有以下几方面： 过酸或过碱使酶变性失活。过酸或过碱使酶变性失活。 pH偏离最适偏离最适pH不多时，酶分子中及底物分子中不多时，酶分子中及底物分子中各可解离基团的各可解离基团的解离状态解离状态发生了变化，不利于底物发生了变化，不利于底物与酶的结合及催化反应。与酶的结合及催化反应。 由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，由于酶分子可解离基团的解离状态发生了改变，导致酶分子导致酶分子构象构象发生改变，不利于底物与酶的结合发生改变，不利于底物与酶的结合及催化反应。及催化反应。最适反应最适反应pH示意示意图图六、激活剂对酶反应的影响六、激活剂对酶反应的影响 有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质有些物质与酶结合后可以提高酶活力，这些物质称为酶的激活剂（称为酶的激活剂（activator）或活化剂，它们大部分）或活化剂，它们大部分是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋是无机离子或小分子化合物，少数是大分子物质如蛋白质。作为激活剂的金属离子有白质。作为激活剂的金属离子有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+ 等，它们与酶蛋白结合后，或稳定等，它们与酶蛋白结合后，或稳定酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。 激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响 不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活不同的激活剂激活不同的酶，有些激活剂激活一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其一种酶，却又抑制另一种酶。激活剂的浓度也对其效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓效应有影响，一定浓度时起激活作用，超过这个浓度又起抑制作用。度又起抑制作用。 在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制在机体内有许多调节酶活力的方式，其中抑制剂和激活剂的调节属于最快速的方式。剂和激活剂的调节属于最快速的方式。 酶底物中间复合物存在的证据酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复光衍射直接观察到酶与底物的复合物。合物。酶与底物结合后光谱发生变化。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。分离到了酶底物复合物。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。现象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同同( (半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧物浓度高于无酶一侧) )。 米氏方程的几个特点米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：从米氏方程中可以看出：当当S Km时，时， ，反应速率达到，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当当S = Km时，时， ，所以，所以，Km的意的意义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底义是使反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。物浓度。mmKSVVmmVSSVV22mmVSSVV多底物的酶促反应多底物的酶促反应（酶促反应按底物分子数的分类酶促反应按底物分子数的分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + BX AX + B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B + ATP AB + AMP + PPi6%抑制作用的类型抑制作用的类型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition） 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。去除而使酶恢复活力。可逆抑制作用的可逆抑制作用的3种类型种类型（3）反竞争性抑制剂（）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition） I 只与只与 ES 结合，只有结合，只有 ES 能分解出产物，能分解出产物，ESI 中中的的 S 不能转变成产物。由于不能转变成产物。由于 I 的存在促进了的存在促进了E和和S的的结合，所以称为反竞争性抑制。结合，所以称为反竞争性抑制。 ES + I ESI P + E + I4种酶的种酶的pH-酶活性曲线酶活性曲线胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胆碱酯酶胰蛋白酶胰蛋白酶