分子生物学合作版.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流分子生物学合作版.精品文档.Section AProkaryotes 原核生物：是指没有成形的细胞核或者任何带膜的一类生物。原核生物包括细菌（真细菌、古细菌）、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体原核生物有细胞膜、细胞壁、环状染色体、质粒（NDA）、核糖核酸（RNA）、蛋白质古细菌有独特的生化特征（eg膜脂由醚键连接），在能量产生和新陈代谢方面，古细菌和真细菌有相同之处。而复制、转录、翻译则更接近真核生物。Eukaryotes 真核生物：是指所有单细胞或多细胞的、其细胞具有细胞核的生物体的总称。真核生物包括动物、植物、真菌、原生生物细胞质：细胞器、核糖体、蛋白质纤维细胞骨架（微管-微管蛋白、微丝-肌动蛋白）原核细胞和真核细胞最主要的区别是有无成形的细胞核Differentiation 分化：指发育的个体细胞中进行形态、功能的特殊变化，并建立起其他细胞所没有的特征的过程。分化是由控制发育的基因来调控，分化而成的细胞中DNA的含量保持不变，只是被转录的基因群体发生了变化。脂类：能量的储存和转移 膜、保护性外鞘及其他细胞结构的组分phospholipid molecule 磷脂分子：2脂肪酸+1磷酸，以酯键相连hydrophilic polar head group and a hydrophobic tail 亲水的极性头部和疏水的尾部磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，形成脂双分子层Glycerides 甘油酯：由一个、两个或三个长链脂肪酸与一份子甘油以酯键相连而成。为酯类，不属于碳水化合物Triglycerides 甘油三酯：由三个长链脂肪酸与一份子甘油以酯键相连而成。动物中：固态，饱和脂肪酸，不含双键植物中：液态，含一个或多个双键的不饱和脂肪酸Polysaccharides 多糖：单糖以糖苷键共价连接而成的聚合体，其功能主要作为营养物质或结构组分纤维素：（14）糖苷键 线性多聚体，链形成水平片层，链与片层间以氢键相连淀粉：直链淀粉（14）糖苷键；支链淀粉（14）和（16）分支 卷曲构型，可溶于水糖原：（14）和（16）糖苷键，动物组织和真菌储存葡萄糖的形式几丁质：N-乙酰氨基葡糖 黏多糖：结缔组织的重要组分Glycoproteins 糖蛋白：分支的寡糖链与多肽链在表面共价相连所构成的复合糖。分支寡链多，以糖为主体。是细胞膜的重要组分，介导细胞与细胞间的识别。蛋白多糖（proteoglycans）：蛋白质与黏多糖组成的大分子复合物。 长糖链，以蛋白质为主体。存在于细菌细胞壁和结缔组织细胞间隙（起润滑剂和缓冲冲击的作用）。Lipoproteins 脂蛋白：脂类和蛋白质非公价结合，通过疏水作用将蛋白质固定在膜中。Chromatin 染色质：由DNA与小分子的组蛋白（碱性pr）组成的脱氧核蛋白复合体。Biomembranes 生物膜：镶嵌有蛋白质和糖类的磷脂双分子层，起着划分和分隔细胞核细胞器的作用。Functions of Membrane 膜的功能：物质运输、能量转换、信息传递Hydrogen bonds 氢键：在供体基团的一个共价结合的氢原子和受体基团上一对非成键电子之间形成。van der Waals forces 范德华力：电中性分子间的非共价结合。Hydrophobic interaction 疏水作用：非极性分子倾向于聚集起来以减小暴露给水的表面积。亲水作用（hydrophilic）：Density gradients 密度梯度差速离心：根据沉降系数值的不同，采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。适用于混合样品中各沉降系数（沉降系数）比较大的分离。由上至下：组分慢组分快密度梯度离心（Density gradient Centrifugation）：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。密度梯度离心用于分离密度相似的细胞器。 建立介质密度梯度的目的：为了阻碍分离后组分的扩散混合，并确保组分的线性分离速率速度区带离心（rate zonal centrifugation）：将样品放在一个连续的密度梯度也提上，通过离心，根据沉降系数的不同，以不同的速度下沉并形成相互分离的区带。 适用于密度相同而大小不同的混合物。由上至下：组分慢组分快平衡（等密度）离心（isodensity centrifugation）：在不同颗粒存在浮力密度差时，在离心立场下，在密度梯度介质中，颗粒向上浮起或者向下沉降，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置。在这里，颗粒没有重量，不管离心时间多长都不再移动。由上至下：低浓度高浓度 适用于大小相接近但密度差异较大的混合物，但溶液介质的密度比要分离的混合物的密度都要大。溶液介质常为CsCl、蔗糖、甘油。Section BAmino acids 氨基酸除了Pro(脯氨酸)外（其是一个亚氨基酸即碳原子连着的是一个亚氨基N-H），氨基酸都由一个羧基相连的-碳原子，一个氨基，一个质子（H），一个侧链（R）组成，除了Gly(甘氨酸)外（其侧链R是一个质子H），所有的-碳原子均具手性（不对称的），即与4个不相同的化学基团相连。Acidicbasicpolarnonpolararomatic amino acids酸性/碱性/极性/非极性/芳香族 氨基酸酸性氨基酸：侧链都含有羧基、-NH2比-COO数目少、PH<7、带负电荷；Asp,D(天冬氨酸)和Glu,E(谷氨酸)碱性氨基酸：侧链都含有氨基、-NH2比-COO数目多、PH>7、带正电的基团；His,H(组氨酸)、Lys,K(赖氨酸)、Arg,R(精氨酸)极性氨基酸：含有可与水形成氢键的基团，Ser,S(丝氨酸)、Thr,T(苏氨酸)、Asn,N(天冬酰胺)、Gln,Q(谷氨酰胺)、Cys,C(半胱酰胺)非极性氨基酸：侧链上有一个氢原子Gly,G(甘氨酸)，或者侧链上带有疏水烷基Ala,A(丙氨酸)、Val,V(缬氨酸)、Leu,L(亮氨酸)、Ile,I(异亮氨酸)；Pro,P(脯氨酸)是亚氨基酸，Met,M(甲硫氨酸)侧链有个以硫酯键相连的硫原子。芳香族氨基酸：有较大疏水侧链，其芳香结构承担蛋白质的紫外吸收，在280nm处最大。Phe,P(苯丙氨酸)、Tyr,T(酪氨酸)和Trp,W(色氨酸)带电氨基酸包括酸性氨基酸和碱性氨基酸。亲水氨基酸包括带电氨基酸和极性氨基酸。Primary structure of protein 蛋白质的一级结构氨基酸的-羧基和下一个氨基酸的-氨基结合形成肽键，如此连接，组成的多肽链。或者说从N端到C端的氨基酸序列。-helix 螺旋肽链骨架形成一个每周3.6个氨基酸的右手螺旋，每个肽的N-H基团都与相距3个残基的C=O基团间形成氢键。常在球蛋白和一些纤维蛋白中发现。-sheet: 折叠由肽键N-H和C=O基团与肽链上另一段互补的基团间以氢键维系的。重要的结构蛋白如丝蛋白。Parallel -sheet 正向平行折叠两段肽链片段走向相同（如N端到C端）Antiparallel -sheet 反向平行折叠两段肽链片段走向相反（如N端到C端和C端到N端）primary structure 一级结构是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序，也称为蛋白质的共价结构。secondary structure 二级结构多肽链折叠成几种由氢键维持的规则结构。Tertiary structure 三级结构不同片段螺旋、折叠、其他微二级结构和连接环进一步折叠成三维构想的组织水平。只有一个亚基折叠就是使带有亲水侧链的氨基酸位于蛋白质外部，而疏水氨基酸埋在疏水的内部。以范德华力、氢键、静电盐桥及存在于芳香族和脂肪酸氨基酸残基间的非极性侧链的疏水相互作用维系三级结构。Quaternary structure 四级结构由两个或两个以上多肽链（亚基）组成。多肽链可以是相同或不同的。其重要性表现在一，可构成很大的蛋白质分子；二，其通过与不同的小分子复合而被修饰，有不同功能，即别构效应的发生。其主要通过疏水作用、氢键、范德华力维持，以疏水作用为主。Domains 结构域在同一条多肽中有限的高度有序结构片段相连而成。Motif 基序DNA、蛋白质等生物大分子中的保守序列。结构基序又叫超二级结构，代表着在不相关蛋白凑在一起时实现结构-功能统一的最佳解决方案。例如基序，折叠片层的两个连续平行链间的连接是一个螺旋。Protein families 蛋白质家族属于某蛋白家族的相关蛋白质和基因被称作是同源。不同物种的具有相同功能，承担相同生化角色的蛋白质家族成员（如大鼠和小鼠的肌红蛋白）为直向同源（定向进化同源）。对于进化不同但功能类似的蛋白为共生同源（平行进化同源）。Protein functions: 蛋白质功能酶、信号传递（受体蛋白质与配体结合）、免疫（抗体）、调节（转录因子与DNA结合并调节其功能）、营养（酪蛋白和卵清蛋白）、转运与储存（血红蛋白运氧）、结构与运动（胶原蛋白组成皮肤）The principal properties of proteins used for purification蛋白质纯化的主要方法 凝胶过滤层析（根据蛋白质的大小来分离）用适当孔径大小的颗粒填充层析柱子，把蛋白质倒进去，比孔径大的蛋白质很快流出来了，用的洗脱缓冲液较少。而孔径小的蛋白质流进填充颗粒里面去了，要用较多的洗脱缓冲液。离子交换层析、等电聚焦、电泳（均根据蛋白质所带电荷不同来分离）把蛋白质放在一块凝胶上，加入电流，蛋白质带的电荷不同会往正极或负极跑，电荷量的多少决定跑的速度快慢，这叫电泳。把蛋白质倒进装有不溶的离子交换剂的层析柱里，让蛋白质置换离子的位置，即蛋白质吸附在层析柱里，然后再用一个离子强度不断增强的盐洗柱子，把蛋白质重新置换出来，这叫离子交换层析。把多聚两性电解质缓冲液和蛋白质混好，加个电流，电解质会在电场作用下形成个从正极到负极的PH逐渐增加的PH梯度，然后不同等电点的蛋白质跑到自己的等电点上就不动了（因为它净电荷为零），这叫等电聚焦。疏水相互作用层析（根据蛋白质疏水性不同）用高离子强度溶液增强蛋白质和层析柱中芳香族物质的疏水相互作用，再用个逐渐降低的离子浓度溶液冲洗蛋白质流出。亲和层析（根据酶或者受体与配体间的特殊亲和性）把酶的竞争性抑制剂作为层析物质，然后把蛋白质倒进层析柱，某蛋白质会和某层析物质特异结合，其余不结合的蛋白质就下来了。globular proteins 球蛋白紧密折叠，在溶液中呈近似球形的颗粒，自然界中绝大部分的酶。其有确定的3D结构，利用X射线晶体衍射可确定蛋白质三维机构。fibrous proteins. 纤维蛋白呈高轴比（长/宽），重要的结构蛋白，如头发与羊毛中的丝蛋白和角蛋白。蛋白质可区分为两大类球蛋白和纤维蛋白。Section CNucleosides（核苷）：一个核苷包含了一个碱基共价结合于戊糖的1位，RNA中戊糖为核糖，DNA中为2-脱氧核糖。 Nucleotide（核苷酸）：由一个或多个磷酸分子共价结合于核苷核糖的3、5位，或2位（仅在核糖核苷中）形成。Hypochromicity (减色性): 双链DNA相对于单链DNA的光吸收值减少的现象。Hyperchromicity (增色性)：单链DNA相对于双链DNA的光吸收值增加的现象。Melting temperature (Tm): 热变性使DNA分子双链解旋到50%时的温度。Linker number (Lk, 连接数): DNA分子中没有游离端，两条链缠绕的数目即为双螺旋的螺旋数，称为连接数。Intramolecular hydrogen bonding and base stacking are the forces for DNA secondary and tertiary structure.分子内氢键和碱基堆积力对DNA分子的二级和三级结构的稳定性有作用。Hydrogen bonding does not normally contribute the DNA stability, DNA Stability lies in the stacking interactions between base pairs. 氢键通常不足以维持DNA的稳定，DNA的稳定性在于碱基对之间的堆积作用。Hydrogen bonding contributes to specific structures of DNA and protein, such as -helix, -sheet, DNA double helix, RNA secondary structure.氢键对DNA和蛋白质的特殊结构有影响，例如螺旋、折叠、DNA双螺旋、RNA二级结构。Stacking interaction/hydrophobic interaction between aromatic base pairs/bases contribute to the stability of nucleic acids.芳香族碱基对间的堆积力/疏水作用为核酸保证了稳定性。Properties of nucleic acids: strong acid and high temperature (such as perchloric acid HClO4 +100), nucleic Acids will be completely hydrolyzed to bases, riboses / deoxyribose, and phosphate.核酸的特性：强酸和高温条件下，核酸会被完全水解为碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸。When nucleic acids is at the condition of moderate acid (such as pH 3-4), glycosylic bonds attaching purine (A and G) bases to the ribose ring are broken into apurinic nucleic acids. 当核酸处于弱酸环境中，连接嘌呤的碱基和核糖的糖苷键将断裂，产生脱嘌呤核糖。High pH denatures DNA and RNA by altering the tautomeric (互变异构) state of the bases and disrupting specific hydrogen bonding.强碱性通过使碱基互变异构态发生变化以及破坏特定碱基间的氢键作用，从而使DNA和RNA变性。RNA can be hydrolyzed at higher pH by participation of 2-OH groups in intramolecular cleavage of the phosphodiester backbone.RNA在高pH环境中水解是由于2-OH参与分子内磷酸酯键的裂解。The conformation (geometry) of the DNA can be altered while the linking number remains constant. 当连接数不变时，DNA分子的几何构型可以发生改变。The topological change (DLk) in supercoiling of a DNA molecule is partitioned into a conformational change of twist (DTw )and/or a change of writhe (DWr).一个超螺旋DNA分子的拓扑异构体被划分为缠绕和扭曲。According to the ratio of OD260/280, how to evaluate the purity of DNA or RNA samples? 根据260/280OD值的比率，如何判断DNA或者RNA样品的纯度？protein-0.5 dsDNA-1.8 pure RNA-2.0 1.8 有RNA裂解，1.8 有蛋白质污染Section DReplicon 复制子以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子.Origin 起始点基因组中单一DNA复制时的所需要的起始序列。含AT碱基对丰富，易解链。真核细胞染色体含有多个起始点，而细菌染色体和质粒中只有一个。Terminus 复制终点（无明确解释）所有原核生物染色体，许多噬菌体以及病毒的DNA分子都成环形并由单一复制子构成，因此与唯一起点成约180度出就有一个单一终点。Replisome (复制小体):DNA复制时，复制叉上结合的由多种与复制有关的酶和辅助因子组成的复合体DnaB: 解旋酶解旋酶是利用ATP水解的能量结合并解开双链DNA（或RNA）的一种酶Proofreading 蛋白质或核酸合成中的纠错机制Semi-conservative replication: 半保留复制在复制中，DNA双螺旋的两条链解开，并分别作为模板指导以5-三磷酸为前提的互补子链的合成.这样每个子细胞接受亲代DNA双链中的一条.这种机制可用密度标记试验来证明.标记实验中用平衡梯度离心杂合分子.Semi-discontinuous replication: 半不连续复制DNA复制时，一条链(前导链)是连续合成的，而另一条链(后随链)的合成却是反方向且不连续的。这是因为DNA复制只能由5-3方向合成Okazaki fragments 冈崎片段在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段。其长度在真核与原核生物当中存在差别，真核生物的冈崎片段长度约为100200核苷酸残基，而原核生物的为10002000核苷酸残基。RNA priming RNA引导前导链及所有的后随链片段的DNA合成都是由短的RNA片段引导起始，然后沿DNA模板延伸。引物在连接前被去掉并填补上DNAProkaryotic genome is a single circular DNA and contains a single replicon.原核生物的基因组是一个单独的环状DNA并含有一个复制子Eukaryotic genome contains multiple linear chromosomes and has multiple replicons on each chromosome.真核生物的基因组包含多个线状的染色体，并且在每天染色体上面有多个复制子。All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circlular and comprise single replicons. 全部的原核生物的染色体和许多噬菌体、病毒DNA分子都是环状并只有一个复制子。DNA primase lead to synthesize a short RNA primer for synthesis of the leading strand.DNA引发酶在前导链上引导合成一段短的RNA引物In cell cycle, which phase is for DNA replication? And describe the replication order for euchromatin, heterochromatin Centromeric DNA and telomeric DNA. 在细胞周期中，DNA复制发生在哪个阶段？并描述常染色质、异染色质、着丝粒DNA和端粒DNA的复制秩序。细胞周期分为G1、S、G2、M期DNA复制发生在S期S: DNA replicationEarly S-phase: euchromatin replication早期DNA复制阶段：常染色质复制Late S-phase: heterochromatin replication晚期DNA复制阶段：异染色质复制Centromeric and telomeric DNA replicate at last 着丝粒DNA和端粒DNA发生在复制的最后。What are the similarities and differences of DNA replication in prokaryotic and eukaryotic cells?原核生物和真核生物细胞中DNA的复制有哪些相同点和不同点？相同：1. Semi-conservative replication半保留复制2. Semi-discontinuous replication半不连续复制3. DNA helicase, SsbDNA解旋酶 ，单链DNA结合蛋白（SSB） SSB含义：保持模板处于单链状态，便于复制，同时还可防止复制过程中单链模板被核酸酶水解4. RNA primingRNA引导5. Proofreading蛋白质或核算合成中的纠错机制(校正)不同：（原核/真核）1. Origin (single/multiple)复制起点（单个/多个）2. Initiation (multiple/one times) licensing factor启动（多次/一次)特许因子3. Rate of replication fork movement (900/50 nt/S)复制叉运动速率（900/50 nt/S）4. Size of Okazaki fragments (1000-2000/100-200 nt) 冈崎片段大小（1000-2000/ 100-200 nt）5. Telomeres and telomerases端粒和端粒酶6. Polymerases (simple/complex)聚合酶（简单/复杂）Section EMutagenesis:诱变 P91用人工方法引起生物发生基因突变或染色体畸变。诱变方法包括物理诱变（physical mutagenesis）和化学诱变（chemical mutagenesis），而这两种方法均可诱发直接诱变和间接诱变。Direct mutagenesis:直接诱变 P92如果一种碱基类似物或配对特性与亲本链碱基不同的修饰碱基在复制叉通过之前未被DNA修复机制去除，结果会引入1个错配碱基，而第2轮复制会将这一突变在DNA中永久固定下来。Indirect mutagenesis:间接诱变 P92在复制叉通过之前，DNA中大部分的损伤都会被直接无差错恢复或切除修复机制所修复。如果未能被修复，与特定DNA聚合酶有关的一种转移损伤DNA合成的易错形式就会发生，结果一个或多个错配碱基被掺入在损伤部分的对应位点。Mutation: 突变 P91突变是DNA碱基序列水平上的永久性变化且可遗传。最简单的突变：point mutagenesis（点突变），即转换（transition）（嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间） ；颠换（transversion）（嘌呤与嘧啶之间）。沉默突变（发生在非编码区、非调节区、密码子第3个碱基位置）没有表型效应，错义突变（missense mutagenesis）和无义突变（nonsense mutagenesis）会改变所编码蛋白的氨基酸序列。Mutagen: 诱变剂 P93能使细胞或生物个体的突变频率显著高于自发突变水平的物理或化学因子。包括物理诱变剂（physical mutagens）和化学诱变剂（chemical mutagens）。物理诱变剂可引起DNA发生断链、碱基及五碳糖的损伤。其中引起DNA损伤的最重要方式是紫外线，可引起相邻嘧啶碱基产生嘧啶二聚体。化学诱变剂可利用碱基类似物（base analogs）诱发直接诱变，还有烷化剂可引起严重破坏损伤从而诱发间接诱变。substitution mutation:置换突变碱基的置换突变，可以是转换（嘌呤与嘌呤之间互换）或者颠换（嘌呤与嘧啶之间互换），如碱基置换发生于编码多肽的区，则因可影响密码子而使转录、翻译遗传信息发生变化，因此可以出现一种氨基酸取代原有的某一种氨基酸。也可能出现了终止密码而使多肽链合成中断，不能形成原有的蛋白质而完全失去某种生物学活性。deletion mutation:缺失突变缺失突变是编码某种氨基酸地密码子经碱基缺失以后,变成编码另一种氨基酸地密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。缺失突变的结果通常能使多肽链错误，丧失原有生理功能，不能组成所需蛋白质。insertion mutation: 插入突变因外源核苷酸序列插入而引起的基因突变。插入可以是自发的(如染色体交换)、感染导致的(如前病毒插入基因组)或人工引起的(如基因工程)。插入引起突变可以是由于改变了基因的编码序列或调控序列所致。DNA damage:DNA损伤 P95损伤是DNA正常的化学或物理结构的改变。这些变化也许会阻断复制或转录，结果是致死性的；也许会通过直接或间接诱变产生突变。DNA的化学不稳定性可产生自发性损伤，如脱氨和脱嘌呤。DNA recombination：DNA重组DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。同源重组（homologous recombination）：在减数分裂过程中，广泛存在着两条DNA分子之间同源区域的交换。位点特异性重组（site-specific recombination）：指非同源DNA的特异片段之间的交换，由能识别特异DNA序列的蛋白质所介导，并不需要RecA或单链DNA。如噬菌体入侵E.coli染色体特定位点。转座作用（transposition）：又称为异常重组（illegitimate recombination），不需要序列间具有同源性，也不是位点特异性重组，因此效率比较低，靠转座子（transposons）或者可转座元件（transposable element）插入目的DNA。 Which conditions could Damage DNA and cause mutations?P95什么条件会导致DNA损伤并导致突变?（突变可看上面）DNA损伤（DNA lesion）：外源化学试剂或射线对DNA的化学作用会导致其化学或物理结构发生变化。这些变化也许会阻断或转录，结果是致死性的；也许会通过直接或者间接诱变产生突变。DNA的化学不稳定性可产生自发性损伤，如脱氨和脱嘌呤。物理因素：紫外线、电离辐射化学因素：烷化剂、碱基类似物What are the three major mechanisms for DNA repair?P98DNA的三种主要修复机制：光复活（photoreactvation）：DNA光解酶（photoreactvating enzymes）可切开嘧啶二聚体的环丁烷恢复其DNA的原初结构。直接修复的一个例子，是无差错。P98切除修复（excision repair）：切除DNA一条链上受损伤片段，以其互补链为模板合成正常DNA片段修复DNA损伤。切除修复是一种普遍存在的修复机制，可在一系列的损伤中起修复作用，并且这种修复是无差错的。有两种形式，即核苷酸切除修复（NER）和碱基切除修复（BER） 错配修复（mismath repair）是切除修复的一种特定形式，用于修复在复制中错配并漏过校正检验的任何碱基，一种纠正DNA复制过程中错配碱基的机制。核酸外切酶识别不能形成氢键的错配碱基，并切除一段多核苷酸，缺口由DNA聚合酶修补及DNA连接酶封口。重组修复：必须通过DNA复制过程中两条DNA链的重组交换而完成DNA的修复。Transpositional recombination is the process that a mobile element is inserted into a target DNA. P103转座重组的过程就是一个移动元件插进目标DNA。 Section FDNA cloning（DNA克隆）：通过将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制的方式，使片段的分离及操作简单化，方便分析。 宿主细胞：大肠杆菌 载体：质粒、噬菌体Subcloning（亚克隆）：将已被克隆的DNA片段由一个载体转移到另一载体的过程DNA library （DNA文库）：由基因组或cDNA的一套随机克隆片段构成，每个片段连在一个独立的载体上，用于分离未知基因。Gnomic Library （基因组文库）：用基因组DNA的随机片段制备而成的文库cDNA library（cDNA文库）: 用来自表达目的基因细胞或组织的mRNA作为来源的文库Probe（探针）： 用于检测与其互补的核酸序列的一小段单链DNA或RNA片段Vector（载体）：自身必须能独立于宿主细胞基因组之外进行复制、分离，有选择标记，服务于克隆，起储存、表达作用。载体分类：质粒（基因组较小的，如基因组文库）；基因组较大的用：噬菌体、黏粒、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）；用于真核磁暴表达的：真核生物载体，如Ti质粒Restriction enzymes（限制性内切核酸酶） ：来自细菌，可将DNA酶切水解呈特定的、可再生的片段，在细菌中起抵抗外源DNA侵入的作用，是进行基因克隆的基本工具。 Plasmid（质粒）：独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性基因的染色体外的小型环状DNA分子，是运载克隆DNA的常用载体。Gel electrophoresis（凝胶电泳）：可根据分子的大小来区分不同的DNA分子，用于克隆中对目的片段进行分离和纯化。Competent cells（感受态细胞）：为了使其能吸收DNA，用Ca2+、Rb+、Mn2+等离子预处理过的细胞Transformation（转化）: 感受态细胞吸收外源DNA的过程。Transformation efficiency（转化率）: 每毫克用于转化的质粒DNA在选择平板上所产生的具有抗生素抗性的菌落数。Please describe the main steps for DNA cloning. （DNA克隆的主要步骤）步骤：1. 用限制性内切核酸酶识别DNA序列 2 . 用限制性内切核酸酶将双链DNA切成小片段 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 4. DNA目标片段的纯化 5 . 目标片段连在质粒载体上 6. 转化（质粒转入大肠杆菌） 7. 克隆DNA的分析Please describe the main steps for DNA subcloning.（DNA亚克隆的主要步骤）步骤：1. 提取质粒DNA（有所需的克隆序列）：初步提取质粒DNA（培养、离心）；纯化质粒DNA（碱裂解法）；提取纯质粒DNA（酚-氯仿抽提法，氯化铯密度梯度+溴化乙锭离心法） 2. 用限制性内切核酸酶切质粒酶 3. 琼脂糖凝胶电泳分离片段 4. 纯化目标片段 5. 目标片段连在新质粒载体上 6. 转化（质粒转入大肠杆菌） 7. 对转化细菌的筛选（在含抗生素的平板上） 8. 重组质粒的分析（限制酶酶切图谱）properties of Plasmids（质粒的性质）. 是独立于细菌染色体外的，能自主复制并能与宿主细胞共生的共价闭合环状DNA分子，具有易分离、易识别的特性Multiple cloning site (MCS), antibiotic gene(s), ori (origin of replication)（多克隆位点，抗生素基因，复制起点） 多克隆位点：具有多个限制酶酶切位点的一段DNA序列，能为选择限制酶或克隆中所用到的酶提供更多的选择性。 抗生素基因：分为抗生素抗性基因（编码抗生素产生菌为提高抗性而产生的修饰酶、细胞因子，从而使抗生素失活，改变作用位点的结构，减少在细胞中的积累的基因。） 、抗生素生物合成调节基因、抗生素结构基因、通过基因重组产生杂合抗生素 复制起点：基因组中单一DNA复制时所需的起始序列（确保质粒的自主复制）Conformation of plasmid and migration in electrophoresis（质粒的结构以及电泳迁移情况） (1) linear（线性）, (2) nicked open circular（开环有切口）, (3) supercoiled denatured（超螺旋变性）, (4) supercoiled, and (5) relaxed circular formations构成未酶切的质粒DNA泳道中有两条斑带：1. 位置较低的是负超螺旋质粒，因为其构型紧密而具有较高的迁移率，迁移较快 2.位置较高的是由于超螺旋DNA的一条链被断裂而形成的开环或有缺口的DNA（即缺刻斑带），因为具有开环构型，所以迁移率较低DNA酶切后会出现两种情况（两种泳道）：1.单一片段 2.五个片段，片段大小不同、DNA分子质量不同，所显示出的斑带也不同，片段较大的其斑带较亮。各个泳道所含的DNA的量不相等，DNA的用量是能将所有片段清晰显示的最适用量。 要精确测定线性片段的大小可根据对比分子量标样泳道，通过对已知片段大小的对数与迁移距离的关系作标准曲线，再在同一凝胶中读取未知片段的迁移距离，带入标准方程，得到其分子大小对数，从而得到未知线性片段的的小。因为环状与线性DNA在凝胶中的相对迁移率取决与电泳条件（温度、电场），所以此方法不能测定未酶解的环状质粒。The recognition site for one enzyme may contain the restriction site for another. probability cleaved other enzymes.（能识别的酶切位点，和其他酶区分开的可能性） 限制酶对酶切位点有极高的特异性，不同的限制性酶有不同的酶切位点the characteristics of restriction enzymes, work conditions for restriction digest, restriction enzymes required.（限制性内切酶的特点，作用条件，） 限制性内切酶在很短的对称的识别序列处对称切割DNA双