基因工程复习.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流基因工程复习.精品文档.基因工程复习总结第一章1. 基因工程：利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术2基因克隆：在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，转入宿主细胞使这得以永久保存和复制的过程称为基因克隆。（基因工程或重组DNA技术则侧重于验证上述过程所获得遗传物质新组合在宿主细胞内的表达与功能鉴定）3.重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。4.基因操作：对生物体的遗传物质进行人为的操作，使之发生修饰和改变的过程。5.遗传工程：用人工手段把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达的技术。遗传工程，也叫基因工程、基因操作或重组DNA技术。说明基因工程的理论基石和技术基础理论基石（三大发现）：DNA是遗传信息的载体；DNA的双螺旋机构模型及其半保留复制机理；中心法则和遗传密码及其通用性。 技术基础（三大发明）：DNA的体外切割和连接；载体和宿主的发现、改造和利用；DNA测序、电泳分离和分子杂交（Southern、Northern 和West Blot） 简述基因工程研究发展历史1953，Watson和Crick阐明DNA的双螺旋结构1961-1966，破译全部遗传密码1971，获得第1个重组DNA分子（美国斯坦福大学的Paul Berg及其同事用限制性内切酶将大肠杆菌的DNA切开，并艰难的与病毒DNA连接，从而获得第一个重组DNA分子）1972，合成了完整的tRNA基因；P.Berg首次构建DNA重组体1973，Boyer和Cohen建立了 DNA重组技术1977，重组人生长素抑制因子在大肠杆菌中成功表达1978，美国Genentech公司在大肠杆菌中成功表达人胰岛素1982，笫一个DNA重组技术生产的动物疫苗在欧洲被批准使用；美国批准重组人胰岛素上市1988，PCR技术诞生：肿瘤敏感基因工程小鼠获美国专利授权1990，第一个体细胞培养方案在美获准；人类基因组计划启动1997，世界上第一只克隆羊问世；转录组学概念提出2003，人类基因组计划的所有目标全部实现2003，中国杨焕明等科学在京完成了对水稻（籼稻）基因组序 列的测定和初步分析简述基因工程研究的主要内容。1）克隆载体的研发 2）受体系统的研发 3）目的基因研究 4）工具酶5）新技术研究（基因枪、放射性同位素探针、PCR等）简述基因工程的主要应用领域1）基因工程药物（重组活性多肽或蛋白、疫苗和DNA疫苗等）2）转基因作物（抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆及生物反应器等）3）转基因动物（乳腺生物反应器）4）工业（纤维素酶、酿造业菌株、抗菌素生产菌株的工程改造，等）5）环保（生物降解塑料原料基因工程和生物防治农药污染基因工程等）用5个词描述基因工程的过程。（找、剪、连、转、选）第二章 天然DNA的制备DNA变性：是指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。DNA复性：变性的DNA的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称为DNA的复性。Tm值 ：将紫外吸收的增加量达最大量的一半时的温度值称为熔解温度（Tm）举例说明浓缩DNA或RNA的方法。 乙醇沉淀法：在含阳离子的DNA溶液中，加入2倍体积的无水乙醇，使DNA沉淀。(采用的一价阳离子盐有NaAc、NaCl或NH4Ac，终浓度分别是0.25、1.0和2.0 mol/L；为了可提高小片段（小于 200 bp）的回收率，可用MgCl2(终浓度为 10 mmol/L)。)乙醇处理通常在4、10 min以上，若片段比较小(小于1kb)，或量比较少(少于0.l pg/ml)，则在20 甚至 70下沉淀，或延长沉淀的时间。此法沉盐，影响酶切。 异丙醇沉淀法：在样品中加1倍体积的异丙醇，冰上10 min 以上，4 下离心(12 000 g以上)10 min，干燥后溶入TE，20 (RNA于80 )保存。此法不沉盐。正丁醇抽提法：向DNA溶液中加入1倍体积的正丁醇，充分混匀，以1600 r/min离心l min，弃上相液体。如此重复至液体达到所需要的体积。然后用水饱和的乙醚抽提DNA溶液两次，去除正丁醇。最后在空气中蒸发乙醚。 聚乙二醇浓缩法：将DNA溶液装人透析袋，置于高浓度的聚乙二醇(PEG600)溶液中，4 下使DNA溶液浓缩至所需要的体积简述DNA与基因工程有关的主要特性。1）变性：在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。如温度变性，90足以使所有的DNA变性；其他, 如pH、离子强度、脱水剂等。2）复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。以上是PCR反应的依据。3）带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。4）水溶解性：DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是DNA提取和分离的依据。 简要说明天然DNA的主要提取过程。1）生物材料的准备 使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且暗培养12天或黄化苗；动物以 肝脏为好，须将胆囊除尽。2）细胞的裂解 裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。细菌可用溶菌酶、NaOH + SDS、煮沸、冰冻或超声波等方法处理。动植物组织，先粉碎材料，再裂解细胞。3）DNA的分离和抽提 根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提DNA。一般先按1:1（V:V）用酚、酚+氯仿、氯仿对裂解液分别进行抽提，以除去蛋白质，然后按2:1用乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下（加1/10 体积的 3M NaAc pH4.8）沉淀DNA。 提取质粒DNA时，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有 DNA沉淀，再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。用RNase水解除去RNA制备大分子DNA应注意的两个原则：防止和抑制内源Dnase对DNA的降解；尽量减少溶液中DNA的机械剪切破坏。第三章分 子克隆工具酶限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。同裂酶：识别序列相同而来源不同的酶。同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。限制性图谱：DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制性图谱（restriction map），或物理图谱平末端；两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。粘性末端：两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂。衔接头：一段已知序列且含有限制性核酸酶切酶识别序列和粘性末端的DNA片段连接子：一个较短的已知序列的且能都被限制性核酸酶切酶切割形成特定粘性末端的DNA片段，片段未被内切酶切割时是末端是平末端。连接酶：六大酶类之一，催化两个不同分子或同一分子的两个末端连接的酶。基因工程中常用的酶有哪些？各有何的用途？限制性核酸内切酶：识别DNA的特异性序列，并在特定位点上切割DNA,将两条链上的一个磷酸二酯键断开，在基因工程操作中，用同一内切酶切割载体和目的基因，以形成相同的末端，用于目的基因和载体连接。DNA连接酶：进行缺刻修复，连接两个DNA分子；一般利用DNA连接酶将载体和目的基因连接起来 DNA聚合酶：催化DNA的合成，通常用于PCR反应，以后的大量的目的基因。何谓定向克隆？如何进行？即将待克隆的核酸分子按一定的方向连接入载体的分子克隆方法1，利用不同的限制性核算内切酶切割目的基因的两端，以形成不同的粘性末端 2，在克隆载体的插入位置设置对应的两种不同的内切酶位点，经对应的内切酶切割后形成与目的基因互补的粘性末端 3，DNA连接酶处理目的基因和克隆载体 （克隆载体插入位置上设置两个不同的限制性内切酶位点，在外源DNA分子两端也放上相应的两个限制性酶切序列，经限制性酶消化后，所产生的DNA黏性末端分别互补结合，外源DNA就可定向插入载体。）说明限制性核酸内切酶产生Star活性的原因及其克服措施。 Star活性因限制酶种类、DNA和反应条件的不同而不同，一般是由于一下原因：高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、Mn2+取代Mg2+ 或高pH。克服措施：减少酶的用量，以避免过分酶切 减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到100150mmol/L 降低反应PH至PH7.0 保证使用Mg2+ 作为二价阳离子等第4、5章 分子克隆载体 1.载体：能将所承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。2.表达载体：含有强启动子、外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达的载体。3.报告载体 ：一种易于用生化方法检测表达产物的基因作为报告基因，通常由p-Basic、p-Enhancer、p-Promoter、p-Control组成的载体。4.质粒载体：以质粒DNA分子为基础构建而成的载体，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA基因文库。5.质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。6.ccc-DNA：超螺旋共价闭环DNA分子7.迁移作用：由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒转移的现象称为迁移作用。8.接合质粒：含tra基因的质粒，分子较大，拷贝数较少，宿主广，不安全，使用时应特别注意（tra基因，指令产生菌毛（pilus），促使宿主与受体接合，导致遗传物质转移）9.非接合质粒：不含 tra基因的质粒，分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。10.显性质粒（表达型质粒）: 除了控制与本身复制和转移相关的基因外，还携带其他基因，使宿主呈现出新性状的质粒。 11.隐蔽质粒：宿主细胞含有，但无异样性状表露的质粒12.Cosmid（粘粒载体）：由质粒和含有cos位点的DNA片段组装成一类新的克隆载体13噬菌粒载体：由质粒和单链噬菌体的部分序列重组而成的载体，称为噬菌粒（Phagemid或Phasmid）。能以质粒的方式进行高拷贝复制（500），在辅助噬菌体存在下，又能以M13噬菌体方式进行复制和包装。14定位整合克隆载体：除了一般质粒克隆载体必须具备的元件外，还含一或两个与整合平台区域核苷酸同源的序列（长度最好在1kb以上）。通过同源重组，把外源DNA片段定位整合到整合平台。15.整合平台：指受体细胞基因组上给定的一个供外源DNA定位整合区域。可处于基因区，也可处于基因间隔区。16.YAC（酵母人工染色体）：是将酵母染色体DNA的端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP1）基因序列克隆到pBR322中，构建成YAC克隆载体。此克隆载体的sup4基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位点EcoRI17.PAC（P1人工染色体）：利用P1噬菌体基因组元件所构建的大片段DNA克隆系统。18.BAC（细菌人工染色体）：利用细菌的F质粒及其调控基因为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA(100300 kb)的细菌染色体克隆载体。19.诱导型表达载体：指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。20.反义表达载体：是利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。21.组织特异性表达载体：是指有一些特殊的调控序列（如启动子）可以调控基因只在一定的组织中有效的表达的载体。22.松弛型质粒：在细菌染色体外能大量独立复制的质粒。每个细菌中可存在数百到数千个拷贝。23.严谨性质粒：复制受到严格控制，每个细胞中的数量只有12个，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，也不复制的质粒。24.附加体：一类在细菌和某些真核细胞中存在的染色体外的遗传物质，能在细胞中独立存在并进行自我复制，也能整合到染色体，随同染色体的复制而进行复制。25.转化子：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，经这一过程而获得外源遗传物质的受体菌称为转化子。26.重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。27.基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。28.限制修饰系统：是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。29.质粒不亲和性：不同质粒因亲缘关系密切等原因而表现出不能寓于同一细胞中的特性30. 多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。31.互补：是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。按来源可将基因克隆载体分为哪几类？并说明各自的主要特点。质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）柯斯质粒载体（cosmid）人工染色体（如YAC、BAC）按功能分类：克隆载体、报告载体和表达载体。作为克隆载体必须具备的主要条件是什么？（1）必须含有允许外源DNA片断组入的合适位点。并且这样的克隆位点应尽可能的多。（2）克隆载体应能携带外源基因进入受体细胞，或能在受体细胞中自我复制；或能整合到受体细胞DNA中同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择用的标记基因。以有利于克隆子的筛选和鉴定。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。作为表达载体必须具备的主要条件是什么？如何鉴定转化子、重组子和转基因生物？第六章 PCR技术及其应用PCR：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。RT-PCR；即反转录多聚酶链式反应，是对特定的RNA分子进行扩增的技术，可分成两个部分：（1）将目的RNA反转录（ RT）形成cDNA;（2）以此cDNA为模板进行聚合酶链式扩增（PCR）。定量PCR：在PCR体系中加入荧光基因，利用荧光信号的累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板定量分析的方法。反向PCR;反向PCR(inverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。RACE：cDNA 末端快速扩增技术是基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA完整序列的方法。简单的说就是从转录本中快速增长cDNA5和cDNA3末端，进而获得获得全长cDNA的方法。（转录本是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。）TAIL-PCR；热不对称交交错PCR是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术以基因组 DNA作为模板， 利用依照目标序列旁的已知序列设计的 3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer, SP)， 和一个较短且Tm值较低的随机简并(arbitrarydegenerate, AD)引物组合， 通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增， 获得已知序列的侧翼序列。巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。特殊PCR主要有那些? 各自的原理是什么?RT-PCR:RNA在逆转录酶作用下可以逆转录形成CDNA,CDNA可以在DNA聚合酶的作用下进行复制扩增。实时定量PCR:反向PCR:荧光基因在PCR反应过程中能产生荧光信号，特殊设备可以识别荧光信号，实时定量PCR通过荧光信号的强弱来监控PCR反应过程。RACE;信使RNA的具有5帽子结构和3多聚A尾巴结构，可以根据这个特点构建引物，其中5端利用酶切割后加上接头，3端可以利用多聚T作为引物，从而快速构建增长cDNA5和cDNA3末端TAIL-PCR: 利用依照目标序列旁的已知序列设计的 3 个较高退火温度的嵌套特异性引物， 和一个较短且Tm值较低的随机简并引物组合， 通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增， 获得已知序列的侧翼序列。巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。如何设计PCR引物?引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右, 有效长度不能大 于 38 mer引物扩增跨度：以500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb引物碱基：G+C含量以40-60%为宜避免引物内部出现二级结构引物 3端的碱基要求严格配对, 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物5有或加上合适的酶切位点引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好试述PCR反应的原理与应用. 原理：类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。应用：PCR技术的主要应用于基因克隆，即利用PCR技术扩增目的基因；基因检测，如遗传病的检测；基因配型，如HLA系统基因分析；基因鉴定，如亲子鉴定第7、8章 目的基因制备与筛选策略SSH（抑制性减法杂交）：是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术，其核心技术是抑制性PCRRDA（代表性差别分析技术）：是一种利用PCR具有指数形式扩增双链，线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的的技术。DDRT-PCR（mRNA差别显示或称差别显示反转录PCR）：是由Liang和Pardee(1992) 建立的一种分离、鉴定差别表达基因的方法，具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。ESTs：利用表达序列标签（EST）即基因序列中一段含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，能特异地标记或表征基因的序列，长100 500 bp，来寻找新基因的策略即为表达序列标签法(ESTs)。酵母双杂交：是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法，是一种研究蛋白质蛋白质之间的相互作用的技术，特别是研究蛋白质亚基和另一亚基的相互作用。cDNA文库：由cDNA的一套随机片段构成，其中每个片断连在一个单独的载体分子上，储存在宿主（大肠杆菌、噬菌体等）中并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组文库：是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。基因文库：基因克隆的群体。包括互补DNA文库和基因组文库等。简述cDNA文库构建的原理与步骤原理：高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶段的单个细胞或个体中，仅15左右的基因表达。可见由 mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。（不明）步骤：先提总RNA，再纯化mRNA。合成第一链cDNA将mRNA-DNA转变为双链DNA将合成的双链cDNA重组到载体上，导入寄主增殖简述基因组文库构建的原理与步骤原理：通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体，（不确定）步骤：提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；阳性重组菌落或噬菌斑的选择。简述酵母双杂交的原理与步骤基本原理：酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的N端1147位氨基酸区段为一DNA结合域（BD），C端768881位氨基酸为一转录激活域（AD）。 DNA-BD识别GAL4效应基因的上游激活序列（UAS），并与之结合。而AD则通过同转录必须的其它成份间的结合作用，启动UAS下游的基因转录。 通过DNA重组把BD与AD分开，并在同一细胞中表达出BD和 AD多肽，但由于彼此间的空间隔离，不会发生相互作用，故不能激活效应基因转录。若将BD和AD分别与来自能结合的两个蛋白的基因融合， BD和AD 则在体内重新组装成具有功能的转录因子（图）， 激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达。步骤：将已知蛋白质的编码基因插入pGBT9，同时把cDNA片段克隆在pGAD424上, 构成cDNA表达文库。提取上述两种质粒，共转化酵母寄主菌株HF7c（具报告基因UAS-promoter-HIS3）。在缺少Leu和Trp的培养基上培养，以便挑选有两种质粒的转化子；同时也在缺少His、Leu和Trp的培养基上培养，以便挑选能表达相互作用的杂合蛋白的阳性菌落，从而克隆到与已知蛋白质相互作用的cDNA 。分离目的基因的方法：1）直接分离：限制酶酶切分离法（适于从简单基因组分离目的基因，如质粒和病毒）物理化学法（DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性质明显不同，如浮力密度和解链温度等）有：密度梯度离心法、单链酶解法及分子杂交法等。双抗体免疫法（适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质）反转录法2）构建基因组文库分离3）构建cDNA基因文库分离4）利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因5）基因的化学合成(自学)筛选目的基因的方法：1）根据功能筛选：特异蛋白分离法（根据特异蛋白的氨基酸序列，按照遗传密码及其简并性人工合成特异简并探针，从文库中筛选相应的基因）。功能互补法（利用克隆片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的互补性直接分离目的基因）。2）根据序列筛选已知基因序列或同源基因序列克隆法表达序列标签法基因表达系列分析法（用来分离不同发育阶段和生理状态下差别表达基因）3）差别杂交及减法杂交法差别杂交法（无可供选择的探针，也无任何有关目的基因的序列信息时，可采用此法；该法特别适于分离特定组织或特定发育阶段特异表达基因以及诱导表达基因）减法杂交技术（通过DNA复性动力学原理富集目的基因，并以此构建减数文库分离克隆目的基因；尤其适于某些低丰度mRNA的cDNA克隆）4）差别显示法mRNA差别显示也称DDRT-PCR（一种分离、鉴定差别表达基因的方法；几乎可检所有表达基因；可同时比较多种细胞类型；可同时展现所有差异；可同时检测基因的上调和下调表达。）代表性差别分析技术抑制性减法杂交（SSH）5）功能结合法6）DNA 插入诱变法（主要用于植物基因克隆分离）有转座子标签法；T-DNA标签法7）基因定位克隆法（是人类或植物基因的克隆中常用方法，主要根据目的基因在基因组上的位置特性而不是编码产物来克隆基因。）8）分子间相互作用克隆法第9章 转基因及其表达转化：重组质粒通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化子：经转化获得外源遗传物质的细胞称为转化子。感受态细胞：感受态细胞指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。融合蛋白：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 转基因沉默（transgene silencing）: 指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象，启动子（promoter）是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。其长度因生物的种类而异，一般不超过200bp。启动子是基因表达调控的重要顺式元件，具有如下特征：序列特异性; 方向性; 位置特性; 种属特异性。增强子（enhancer）: 能够增强启动子转录活性的DNA序列。其结构类似于启动子，由1多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。增强子长501500bp终止子（terminator）: 终止转录的序列。绝缘子（insulator）：是基因表达的调控元件，也是一种边界元件，能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用。SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游712个核苷酸处的一种47个核苷酸的保守片段，它与16S rRNA 3端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。外显子：基因组DNA中出现在成熟RNA分子上的序列。外显子被内含子隔开，转录后经过加工被连接在一起，生成成熟的RNA分子。信使核糖核酸(mRNA)所携带的信息参与指定蛋白质产物的氨基酸排列。内含子：真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因。在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。反义RNA（antisense RNA）是一类与特定 DNA序列互补的小分子RNA。 编码反义RNA的DNA称为反义子RNA interference (RNAi)：由双链RNA启动，在多种酶参与下，经过一系列步骤（包括siRNA的形成和双链降解等）将同源RNA降解的现象。简述转基因的主要方法与原理1）转化Ca2+诱导的转化(Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热击收缩，使胞膜出现空隙，便于外源DNA进入。)电穿孔法转化(在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。)三亲本杂交接合转化原生质体转化基因枪转化2）转导: 通过噬菌体（病毒）颗粒感染途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。简述重组子的筛选与分子鉴定的主要方法和原理筛选：1）载体遗传标记检测抗药性筛选法营养缺陷型筛选(载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子)显色筛选法(载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选)2）克隆DNA序列检测（可用于鉴定）限制性酶切图谱法(对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。)菌落噬菌斑原位杂交法(根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。)DNA序列分析法(在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列)3）外源基因表达产物检测重组子的分子鉴定1）分子大小鉴定2）限制酶酶切3）利用PCR方法筛选确定重组子4）核酸分子杂交检测法（具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。该技术用于重组子鉴定时，杂交的双方是待测序列和已知核酸片段（称为探针）。）真核基因表达调控的特点：表现为在特定的时间和特定的细胞内或在特定外界条件下特定基因表达，从而实现有序的、不可逆转的分化发育过程。因此，特定基因的表达依赖于一套特定的转录因子与DNA调控元件之间的相互作用。大多数真核生物的增强子包含多个不同转录因子的结合位点。当信号传至细胞核时，触发特定激活物与特定增强子准确结合，形成蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用的网络，从而激活或促进转录。说明转基因沉默的机制与克服措施。转基因沉默（transgene silencing）: 指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象，其机制主要有：1）位置效应：指基因表达受其在基因组中的位置影响的现象克服措施：基因打靶（定位整合）。2）转录水平沉默：是在DNA水平上的基因调控，主要由启动子甲基化或外源基因的异染色质化引起。克服措施：筛选单拷贝插入重组子、选用限制修饰系统缺陷型受体细胞。3）转录后水平沉默：是在RNA水平上的基因调控，更普遍。特点是外源基因能够转录，但mRNA合成后就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。克服措施：尽量避免（如利用编码序列的简并性等）。4）翻译后沉默：主要是受体细胞的蛋白酶降解外源蛋白。克服措施：融合表达、分泌表达、包涵体表达、选用蛋白酶缺陷型受体。作为基因工程宿主必须具备的主要条件：便于重组DNA导人。 能使重组DNA稳定存在。 便于重组体的筛选。 遗传稳定，易于扩大培养或发酵生长。 安全，无致病性，不造成环境污染。 利于外源基因表达产物积累，或能促进其高效分泌表达。 遗传密码无明显偏倚性。 具有较好的翻译后加工机制。 应用价值高。第10章 细菌基因工程融合表达: 目的基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，构建成一个融合蛋白基因，不改变两个基因阅读框的基因表达方式。融合蛋白: 将外源基因与受体菌基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框而表达的蛋白。分泌表达: 外源基因含有指导信号肽的表达的序列，使得表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基的基因表达方式包涵体: 包涵体是在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。转导：借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿主基因组上的方法。转化：通过外源DNA片段传递遗传信息的过程。转染：利用物理，化学的方法使受体细胞从环境中吸收DNA的方法表面展示: 将外源基因的表达产物定位在微生物表面的基因工程技术试述促进转基因在大肠杆菌中表达的策略。答：1、优化表达载体的设计2、提高稀有密码子tRNA的表达作用3、提高外源基因mRNA的稳定性4、提高外源基因表达产物的稳定性5、优化发酵过程简述原核生物基因工程常用的载体和受体细胞。答：原核生物基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌，蓝藻等 常用的载体：大肠杆菌表达载体PBR-322，PUC-18，PUC-19;Gst融合表达载体PGEX,枯草芽孢杆菌整合载体PDG1730.简述细菌基因工程的主要应用？答：1、在农业领域中生产基因工程农药，抗虫抗病重组微生物，微生物肥料等。2、在食品和工业中生产基因工程菌，以产生改良的益生菌，生产酶制剂等。3、重组DNA技术生产医用抗生素4、利用环境微生物基因工程菌处理环境中的废弃物简述外源基因在细菌中的主要表达形式及优缺点。 答：包涵体 优点：主要存在于细胞质，少数在细胞周质中；易于分离纯化：包涵体水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可分离；对蛋白酶有较好的抗性。缺点：没有正确的空间构象，因而无生物活性。融合蛋白 优点：利用tag的特性对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，因而大大简化了重组蛋白的纯化过程；保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解 缺点：进行基因工程操作比较复杂，成功融合的蛋白种类不多分泌型蛋白 优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率；有利于形成正确的构象，获得较好的生物学活性或免疫原性的蛋白质。 缺点：要在外源蛋白的N端加入添加编码信号肽的DNA序列，基因操作相对复杂，同时不能确保高效的分泌。整合型外源蛋白 优点：外源基因整合在染色体特定部位，随着基因组基因稳定的转录和表达 缺点：需整合的载体一般是不能在受体细胞内进行自主复制的质粒或温度敏感型质粒。第11章 酵母基因工程YEp（酵母附加体质粒）YIp (酵母整合质粒):是以细菌质粒为基础并携带有一个段酵母基因能整合到酵母染色体上YRp（酵母复制质粒）YCp（酵母着丝粒质粒）营养缺陷型：对某些必需的营养物质(如氨基酸)或生长因子的合成能力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基(如由葡萄糖和无机盐组成的培养基)中补加相应的营养