基因工程的定义.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流1.2.3.4. 基因工程的定义.精品文档.5. 基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2. 碱抽提法提取质粒DNA 原理和步骤3、DNA的定量和纯度测定1. 紫外光谱法6. 琼脂糖凝胶电泳估计原理：7. DNA的凝胶电泳的原理相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。4. 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。功能 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：5端凸出（如EcoR I切点）；端凸出（如Pst I切点）限制性内切酶识别的序列1. 长度：一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。 4个碱基:sau3A 5 个碱基:EcoR 6个碱基:EcoR 7个碱基:BbvC 8个碱基:Not限制酶识别序列的结构大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。有些识别非对称序列，有些可以识别多种序列，ACC识别序列是GT Ü MKAC,可以识别4中序列；有些识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基位点偏爱 (site preferences)某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。酶切反应条件 缓冲液，反应温度，反应时间，反应中止星星活性(star activity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。引起星星活性的因素 高浓度甘油（>5%） 酶过量（>100U/mg） 低离子强度（<25mM） 高pH (>pH8.0) 有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane 用其它二价阳离子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+, Zn+ 不同的酶对上述条件的敏感性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感同裂酶（Isoschizomers)识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。 同尾酶(Isocaudamers）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项1. DNA的纯度 DNA聚合酶3®5外切酶活性5®3外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) T4DNA 连接酶的功能主要是催化双链DNA一端的3-OH与另一双链DNA 5端的磷酸根形成3,5-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。 大肠杆菌DNA聚合酶 I一条单链多肽。5®3外切酶活性位于N端。 5®3DNA聚合酶活性 3®5外切酶活性在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得dsDNA成为平末端。Klenow fragment具有5®3聚合酶活性和3®5外切酶活性。（失去了5®3外切酶活性）。在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响。逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。来源 RNA肿瘤病毒。AMV的性质二链多肽(62kDa/94kDa)具5 3DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)碱性磷酸酶该酶可从DNA分子的5端去除磷酸基碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5磷酸，以防止自身连接。 核酸分子杂交定义用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。核酸探针1.定义： 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。探针的分类： 据制备方法及核酸性质不同，可分为：1 基因组DNA探针2 cDNA探针3 RNA探针4 寡核苷酸探针Southern 印迹杂交琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段 凝胶上DNA变性 中和 DNA转印至NC膜 预杂交 限制性内切酶酶切后（EDTA，65灭活限制酶） 变性液（碱变性） Tris缓冲液 高盐下 烘干、固定 杂交 放射自显影 结果分析 Taq DNA 聚合酶1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段PCR基本原理 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。PCR的特点1）特异性强 2）敏感性高 （3）快速 （4）简便 （5）可以扩增mRNA Pfu DNA Polymerase有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！ 引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。重组DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达 目的基因的获取1. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准· 能自主复制；· 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；· 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；· 分子量小，以容纳较大的外源DNA。外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接2. 平端连接3. 同聚物加尾连接4. 人工接头(linker)连接重组DNA导入受体菌感受态大肠杆菌的制备用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性感受态细菌:是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。 重组体的筛选感受态细胞: 经一定方法处理(如CaCl2处理)后具备接受外界DNA能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株。（容易接受外源DNA的状态） 方式: 转化、转染、感染l 转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。l 转染：重组DNA导入真核细胞的过程。l 感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌重组体的筛选· 1.遗传检测法· 抗药性标志的选择· 标志补救（ß-半乳糖苷酶法）· 2. 电泳检测法· 3.PCR检测法· 4. 菌落杂交筛选法· 5. 免疫化学检测法· 6. DNA序列检测E.coli表达体系优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。4）表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 5）很难表达大量可溶性蛋白外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1. 细胞质中表达（1）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。2. 周质中表达3. 胞外表达二、克隆载体Ø 复制基因(replicator)Ø 选择性记号Ø 克隆位点