微生物生理学实验指导圈起来的不做.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物生理学实验指导圈起来的不做.精品文档.微生物生理学实验铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定目 录实验 铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理实验一 细菌总DNA的提取与检测实验二 铜绿假单胞菌fabI基因PCR扩增实验三 铜绿假单胞菌pafabI基因表达载体构建实验四 质粒的提取与检测实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化实验六 遗传互补大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株实验七 铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶的原核表达实验八 铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶纯化实验九 体外鉴定烯酯酰ACP还原酶的酶活性实验十 构建铜绿假单胞菌fabI突变菌株实验十一 菌落PCR筛选重组子实验十二 铜绿假单胞菌脂肪酸合成分析实验报告实验 铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理脂肪酸的生物合成是一种细胞生物体重要的基础代谢。生物体脂肪酸合成系统（FAS）为磷脂和类脂等生物质膜组分提供重要的前体物质，同时生物体内一些重要的化合物如硫辛酸、生物素以及细菌群体感应的信号分子等也都需要以脂肪酸合成代谢中的中间产物为前体物质合成。在不同生物体内，脂肪酸的生物合成过程的基本原理是相似的，但是催化反应的蛋白序列和结构则有着很大的差异。根据合成酶系统的这种差异，人们将脂肪酸生物合成系统分为I型脂肪酸合成酶系（FASI）和II型脂肪酸合成酶系（FAS II）(Cronan, 2006)。I型脂肪酸合成酶系主要分布在哺乳动物和真菌等生物中，该种脂肪酸合成由一个（或两个）分子量较大的多功能酶蛋白催化。这种多功能酶蛋白有多个不同功能的结构域，脂肪酸延伸循环中的各个反应分别在酶蛋白的不同结构域进行(Heath et al, 2002a; White et al, 2005)。II型脂肪酸合成酶系主要分布在细菌，植物和原生动物中，该类生物的脂肪酸合成由一组独立存在的酶催化完成，该系统中各个独立的酶蛋白分别行使一种功能(Cronan, 2006; White et al, 2005)。细菌脂肪酸的合成过程中，酰基链通过硫脂键连接在酰基载体蛋白（ACP）上。ACP是一种小分子量蛋白，一般由70-80个氨基酸残基组成，是FAS II的核心成员之一。以大肠杆菌为例，说明脂肪酸合成的路径。1. 脂肪酸合成的起始：脂肪酸合成的起始反应是以细菌体内的乙酰辅酶A（acyl-CoA）及CO2合成起初的四碳的短链脂肪酸的过程，该四碳的短链脂肪酸产物是酰基链延长反应的基础(Revill et al, 2001; White et al, 2005)。此过程通过羧化、转移、缩合三步来完成：第一步，羧化：乙酰CoA在乙酰辅酶A羧化酶（ACC）作用下转化为丙二酸单酰辅酶A（Mal-CoA）。ACC有4个独立的蛋白构成（AccA，AccB，AccC，AccD），其中AccB的行使功能需要生物素作为共价结合的辅因子(Cronan et al, 2002)。第二步，转移：Mal-CoA在丙二酰转酰基酶（FabD）的作用下将丙二酸单酰基团转移至ACP上，形成Mal ACP(Jackowski et al, 1987)。第三步，缩合：在酮脂酰ACP合成酶III（KAS III，FabH）的作用下将乙酰CoA所携带的酰基链合缩合到Mal-ACP上，生成酮丁酰ACP，起始新的酰基链的生成(Revill et al, 2001)。图1 大肠杆菌脂肪酸合成途径2. 酰基链的延长：FASII中有四种关键酶行使碳链延长的功能，该延长过程是以循环的形式进行，每次循环都经过缩合、还原、脱水、再还原四个步骤，使脂肪酸碳链延长两个碳原子(White et al, 2005; Zhang et al, 2008a)。第一步，缩合：碳链的延长是由酮脂酰ACP合成酶（b-ketoactyl-ACP synthetase，KAS）来催化完成的。延伸反应中酮脂酰ACP合成酶有KAS I （FabB）和KAS II （FabF）两种。每次缩合反应，碳链延长两个C原子，同时在酰基链的位引入一个酮基(Bergler et al, 1992; D'Agnolo et al, 1975)。第二步，还原： KAS在延长碳链的同时引入了位酮基，该基团在酮酯酰ACP还原酶（b-ketoactyl-ACP reductase，KAR，FabG）的作用下加氢还原，转化为羟基集团，将酮酯酰ACP转化成为羟酯酰ACP，同时将还原剂NADPH氧化(Price et al, 2001;2004)。第三步，脱水：羟酯酰ACP脱水形成反2稀酯酰ACP为一可逆反应。该过程由不同底物专一性的两种羟酯酰ACP脱水酶（b-hydroxydecanoyl-ACP dehydratase，HAD）：FabZ和FabA催化完成(Iram et al, 2005; Mohan et al, 1994)。第四步，再还原：循环反应的最后一步由烯酯酰ACP还原酶(FabI) (enoyl-ACP reductase，ENR)来催化完成，将反2烯酯酰ACP还原为饱和酯酰ACP，同时消耗辅因子NADH (Heath et al, 1995; Heath et al, 2002b; Massengo-Tiasse et al, 2008)。各种细菌间FAS的成分不同，最终的脂肪酸酰基链的长度也有所不同。一般延伸到16-18个碳原子的链长的脂酰ACP时，碳链停止延长，作为磷脂合成的前体物质被利用(Zhang et al, 2008a;b)。铜绿色假单胞菌（pseudomonas aeruginosa），医学上称绿脓杆菌，是假单胞菌属（pseudomonas）中极为重要的一个种。该菌是革蓝氏阴性细菌，杆状，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。本实验的目的就是搞清楚铜绿假单胞菌是否有fabI同源基因，若有PafabI的功能怎样？是否与大肠杆菌的FabI的功能相同抑或有一些相异的功能。因此我们将本次微生物生理实验的课程名定为铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定。2000年，铜绿假单胞菌PAO1菌株全基因组测序完成，并由61位科学家组成的科研小组完成了其基因组的注释工作。PAO1菌株基因组全长6,264,403bp包含有5565个基因或者假想基因。铜绿假单胞菌基因组测序及注释工作的完成，为研究铜绿假单胞菌脂肪酸合成路径提供了方便。我们可以根据同源序列法克隆目标基因。目前，世界上主要的基因库有:(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。从上述数据库中查询所要研究的目标蛋白或基因，然后从中获得基因的全长序列。根据整个基因序列设计特异的引物，通过PCR从基因组中克隆该基因。实验一 细菌总DNA的提取与检测一、 实验器材铜绿假单胞菌PAO1；WTL缓冲液；PCP缓冲液；异丙醇；70%的乙醇；RNase A；1.5 ml离心管；各种枪头；移液器；水浴锅；高速台式离心机；旋转蒸发仪；琼脂糖凝胶电泳系统；紫外分光光度计。二、 目的要求(1)了解常用的细菌总DNA制备方法的原理和适用范围。(2)学习细菌总DNA的操作技术。三、 基本原理细菌基因组的大小一般为1-5 Mb。制备纯的质量高的总DNA是进行细菌基因组分析、基因克隆和遗传转化研究等的基础。细菌总DNA的制备方法很多，但大都包括两个主要步骤：先裂解细胞，接着采用化学或酶学方法除去样品中的蛋白质、RNA、多糖等大分子，本实验采用Omega公司的SQ Tissue DNA Kit方法简化了提总DNA的步骤，样品首先用WTL缓冲液裂解细胞，用PCP缓冲液使蛋白质沉淀下来，而总DNA存留在上清液中，然后用异丙醇沉淀得到高质量的细菌总DNA。四、 操作步骤(1)细菌总DNA的提取（按Omega的Bacterial DNA Kit方法）1. 用1.5 ml离心管收集1.0 ml过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液10,000 rpm室温离心1 min，每个组收集两管进行后面的操作；2. 去上清液，加入180 l TE 溶液，充分悬浮细胞后，加入20 uL IS溶液，室温保存10 min；3. 5,000 rpm 离心5min，去上清，加入200 uL BTL溶液充分悬浮细胞；（可选择步骤：对于G+细菌，加入30 uLGP溶液，剧烈震荡5min；将上清转移至另一个离心管。）将样品于55°C水浴60 min使细胞裂解完全。4. 加入25L蛋白酶K，充分混匀，将样品置于55°C水浴60 min，没10 min颠倒混匀一次，使细胞裂解完全。5. 加入5L RNase A 颠倒数次混匀，室温静置20min，（可选择步骤：10,000rpm 离心5min，转移上清至另一个干净离心管）6. 加入220 uL BDL溶液，充分混匀，65°C水浴10 min，加入220uL无水乙醇，充分混匀，如果有沉淀，吹打去除沉淀。7. 将上清转移至吸附柱中，10,000rpm离心离心1min，去承接液；8. 加入500L HB溶液，10000rpm离心离心1min，去承接液；9. 加入500L WB溶液，10000rpm离心离心1min，去承接液；10. 重复步骤9一次11. 12000rpm离心2min12. 将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管中，加入100L EB溶液，静置3min13. 10000rpm离心1min，收集洗脱液。(2)琼脂糖凝胶电泳检测总DNA1. 清洗并安装好的制胶槽，插入适当的梳子。2. 称取0.5 g琼脂糖于三角瓶中，加入50 ml 0.5 × TBE电泳缓冲液，称量三角瓶总重量。摇匀后放在微波炉上加热并且不断摇动，至琼脂糖完全溶解，加水补足原重。待冷却到约50°C后（不烫手为宜），加4 l GoldView，摇匀后倒入摆好的18孔制胶板中冷却凝固，1 h以后使用。3. 凝固后垂直向上拔出梳子。连同制胶板一同取出凝胶，清理制胶板下侧和制胶槽内的碎胶，放入已装有0.5× TBE电泳缓冲液的电泳槽中，以浸过胶面5 mm为宜。4. 用移液器吸取适量DNA样品，1 l 10 x loading buffer在点样板上混匀后点样，记好各组的点样孔位置。5. 情况需要时，可在另一点样孔中加入3-5l标准分子量DNA Marker；6. 调节电压至100V-120V，直至蓝色溴芬蓝条带到达凝胶2/3-3/4处可断电；7. 将凝胶置于紫外透射检测仪上，于305 nm观察样品的亮度和带形并拍照记录。附：TBE电泳母液（10×）的配制1） 分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）2） 将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升.3） 在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合.4） 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.实验二 铜绿假单胞菌fabI基因PCR扩增一、 实验器材铜绿假单胞菌PAO1 DNA模版；目的基因fabI的特异引物对；10×PCR Buffer；5mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各5mM；Taq酶；0.2 ml离心管；各种枪头；移液器；高速台式离心机；PCR扩增仪；琼脂糖凝胶电泳系统；紫外分光光度计。二、 目的要求(1)了解引物设计的方法和要求，了解AT克隆的原理。(2)学习PCR扩增的操作技术。三、 基本原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93°C-94°C）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72°C将单核苷酸从引物的3' 端开始掺入，以目的基因为模板从5'3' 方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等多方面。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基应随机分布，在3' 端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。(4) 引物3' 端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内，尤其在3' 端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3' 端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5' 端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5' 端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3'端应不存在简并性。PCR产物的AT克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3' 末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3' T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。四、 操作步骤(1)PCR反应1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.2 ml离心管中。表2.4.1 PCR反应体系成分用量10×PCR buffer3LdNTP mix (10 mM)1L上下游引物混合 (5 M)1LTaq酶（1U/L）1LDNA模板（20 ng-100 ng）1LddH2OTo 30L注：1. 如果DNA模板中G+C含量过高，可以在反应体系中添加5%的甘油和5%的DMSO；2. DNA模板浓度不需要严格定量，根据不同需要，模板使用量有所不同，菌落PCR中可以直接挑取少量菌体作为DNA模板。2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上进行扩增，PCR程序如下表所示。表2.5.2 PCR反应基本程序步骤温度时间预变性94°C3 min变性94°C30 sec退火58°C30 sec延伸72°C1 min循环35times充分延伸：72°C10 min结束End注：退火温度一般为引物Tm值3°C，Taq酶延伸时间为1min/kb，pfu酶延伸时间为2min/kb3结束反应，PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。(2)PCR产物的电泳检测如在反应管中加有石蜡油，需用100 l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5 l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。(3)PCR产物的纯化/回收（由于时间关系此实验没有安排）PCR产物经电泳后，若有合适大小的DNA片段的特异扩增，则需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。(4)PCR产物的AT克隆（由于时间关系此实验没有安排） AT克隆的原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3' 末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3' T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。1连接反应一般在灭菌的0.2 ml离心管中进行。210 l体积反应体系如下：取T载体1l (50 ng)，加入等摩尔数PCR产物。 加入含ATP的10×Buffer 1l，T4 DNA连接酶，用ddH2O 补足至10 l。3稍加离心，通常为14-16°C水浴连接8-14 hr，或4°C过夜。4转化后进行蓝白斑筛选获得阳性克隆实验三 铜绿假单胞菌pafabI基因表达载体构建一、 质粒载体构建方案本实验中主要用到pMD19-T、pBAD24M、pET28(b)三种克隆和表达用质粒载体。首先PCR扩增基因并将目的基因克隆到pMD19-T载体上，然后通过DNA限制性内切酶酶切和粘性末端连接将基因转移到所需要的表达载体上，从而构建了三个系列的质粒，如下图所示。图3.1 质粒载体构建方案二、 构建质粒载体采用PCR反应，从铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组中扩增出pafabI基因，连接pMD19-T载体，得到pafabI-T个质粒。通过NdeI和HindIII两种限制性DNA内切酶，将pMD19-T载体携带的pafabI基因克隆到pBAD24M及pET28(b)载体上。pBAD24M载体具有pBAD启动子，所携带的基因受阿拉伯糖诱导调控；pET28(b)载体上具有T7启动子，该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后，所携带的基因能在IPTG诱导的T7 DNA聚合酶作用下高效表达。另外，pET28(b)载体表达6×His-Tag融合蛋白，可用于Ni-NTA琼脂糖介导的亲和层析纯化。实验四 质粒的提取与检测一、 实验器材1、材料pBAD24m-FabI（5.3kb）和pET28-FabI（6.8kb） 单菌落平板；1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管)；离心管架；枪头。2、试剂LB液体培养基、固体培养基（灭菌）、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）3mol/l NaAc (pH5.2)：50 ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4°C冰箱。溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4°C冰箱。溶液：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1 SDS。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100 ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L。 HB缓冲液：DNA wash buffer：TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4°C保存备用。脂糖凝胶电泳试剂：5 × TAE buffer：（实验室提供）0.5 × TAE buffer：500ml/班1%琼脂糖胶：20ml/班Goldview10 ×loading buffer3、器具微量取液器(20l,200l,1000l)；台式高速离心机；恒温振荡摇床；高压蒸汽消毒器(灭菌锅)；涡旋振荡器；电泳仪；琼脂糖平板电泳装置；离心管；离心管架；点样板；废液缸；酒精灯；接种环。二、 目的要求(1)学习和掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理、方法和技术。(2)为下次质粒的转化提供实验样品。三、 基本原理把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁；十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。此次实验我们用另一种染料Goldview，在紫外线的激发下，发出绿色荧光。四、 操作步骤(1) pBAD24m-FabI和pET28-FabI小量抽提质粒1、每组分别接种pBAD24m-FabI和pET28-FabI单菌落至5 ml LB（100 g/ml Amp）的15ml离心管中，37°C，180 rpm培养过夜；2、取上述各菌株1 ml培养液于1.5ml 离心管中做好标记，10000 rpm离心min，弃上清。为了提高抽提质粒的量，可再收集1 ml菌液。将离心管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于250 l溶液中(可涡旋或枪头抽吸)。4、加入溶液250 l，温和颠倒离心管4-6次裂解细胞(千万不要振荡)。5、加入350 l溶液 ，温和颠倒离心管4-6次至白色絮状沉淀混匀，12000 rpm离心10 min。 6、将上清液转移到带收集管的离心柱中（做好标记），静置2 min，10000 rpm离心1min后，弃收集液。7、加入500 l HB缓冲液到离心柱中，10000 rpm离心1min，弃收集液；加入600 l DNA Wash Buffer到离心柱中，10000 rpm离心1min，弃收集液；8、13000 rpm空离心1 min，去除残留的缓冲液。将离心柱放到一支干净的1.5 ml离心管中，放在真空泵中抽真空5 min；9、向风干的离心柱中加80 l EB或TE，注意加到离心柱中央吸附膜上，室温静置2 min，12000 rpm离心1 min。10、离心管中收集到的液体即为抽提得到的质粒溶液。取5 l做琼脂糖凝胶电泳检测，其余质粒DNA交回至20°C冰箱中保存备用。(2)琼脂糖凝胶电泳检测质粒 配胶：称取0.25g琼脂糖于三角瓶中，加入50 ml 0.5 × TAE电泳缓冲液，称量三角瓶总重量。摇匀后放在微波炉上加热并且不断摇动，至琼脂糖完全溶解，加水补足原重。待冷却到约50°C后（不烫手为宜），加5 l GoldView，摇匀后倒入摆好的18孔制胶板中冷却凝固，1h以后使用； 点样：小心垂直向上拔出梳子，将凝胶块取出，擦掉槽外和槽底的碎胶，放入已装有0.5× TAE电泳缓冲液的电泳槽中，以浸过胶面5mm为宜，取5 l质粒、1 l 10 x loading buffer在点样板上混匀后点样，记好各组的点样孔位置； 电泳：接通电源，110V电泳30 min左右，当蓝色指示剂（溴酚蓝）移动至胶的1/2左右时，即可观察； 将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，于305 nm观察样品的亮度和带形，判断质粒抽提得质量（可以拍照），记录结果并做分析。实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化一、 实验器材1、材料质粒：pBAD24m-FabI和pET28b-FabI菌株：JP1111、E.coli BL21，2、试剂LB液体培养基、固体培养基（灭菌），氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）0.1mol/L MgCl2溶液、0.1mol/L CaCl2溶液。 3、器具恒温摇床；电热恒温培养箱；冷冻离心机；台式高速离心机；无菌工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；制冰机；分光光度计；移液枪。二、 实验目的学习如何制备化学感受态细胞以及热机转化方法，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子的常用方法。三、 实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。在自然条件下，很多细菌都可自主地摄取外源DNA，但自然条件下的摄取效率很低，在基因工程的操作中，转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的化学感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70°C保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。用CaCl2处理受体菌的基本原理为：当宿主菌处于冰冻的CaCl2溶液中，细菌细胞在低渗透作用下吸水膨胀成球形，细胞膜处于膨胀易裂状态。转化混合物中的DNA与溶液中的Ca离子形成抗DNase的羧基钙磷复合物粘附于细胞表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。并在选择培养基上培养，分离出转化子。四、 操作步骤1、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli JP1111、E. coli BL21单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37°C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以取50µL加入5 ml LB液体培养基中，37°C（BL21）/30°C（JP1111）振荡培养4小时至OD6000.4-0.6之间。2、感受态细胞的制备(CaCl2法)（1）将1ml培养液转入无菌1.5mL离心管，4°C 5000rpm离心5分钟收集细胞。（2）弃去上清，用预冷的0.1 mol/L的MgCl2溶液300µl轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4°C 5000rpm离心5分钟。（3）弃去上清，加入预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液100µl轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟，即成感受态细胞悬液。3、转化（1）加入pBAD24m-FabI（JP1111）和pET28b-FabI（BL21）质粒各2 µl于相应的感受态溶液中轻轻摇匀，冰上放置30分钟。（2）42°C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟。 （3）向管中加入600 µl LB液体培养液(不含抗生素)，混匀后30/37°C振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态。（4）将上述菌液摇匀后取100 l 涂布于含相应抗生素（pBAD24m-FabI：LBAmp 30°C）和（pET28b-FabI：LBKan 37°C）的筛选平板上，培养皿倒置培养16-24小时，第二天观察转化结果。附注：为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素。1. 细胞生长状态和密度：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3. 试剂的质量：所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR或AR)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。实验六 遗传互补大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株一、 实验器材实验材料：携带有pBAD24M-FabI质粒和对照质粒pBAD24M的大肠杆菌JP1111菌株。实验试剂：LB固体培养基、阿拉伯糖实验仪器：恒温培养箱、接种针、超净工作台二、 目的要求理解细菌遗传互补的原理，掌握遗传互补的操作方法。三、 实验原理遗传互补作用：当一个细菌细胞中的某个野生型基因A发生突变而失去活性时，细胞因为突变性基因的缺陷而使细胞出现变异的生长表型；而具有相同或者相似功能的外源基因B进入该突变体时，由于B基因的表达和功能的行驶，补偿了A基因突变带来的缺陷，使得细胞的生长表型恢复正常。遗传互补作为体内验证基因功能的主要方法，通常我们将需要研究的某个基因在基因组上进行各种突变处理，筛选出突变体，然后将分离得到的特定基因导入突变体，通过观察突变体是否恢复功能，来验证该基因的功能。由于大肠杆菌fabI基因为大肠杆菌的必需基因，所以fabI基因的突变使大肠杆菌不能够在正常的培养基上生长，在此实验中，我们使用的fabI基因的突变株为温度敏感型突变株JP1111，该突变株在30°C条件下可以表达正常功能的FabI蛋白，而在42°C条件下，该蛋白则失去活性，使得细胞无法正常生长。四、 实验步骤JP1111 JP1111 pBAD24M pBAD24M -FabI JP1111 JP1111 pBAD24M pBAD24M -FabI