微生物有关知识.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物有关知识.精品文档.微生物有关知识微生物的特点、概念与分类1、微生物的概念微生物是一群体积微小，结构简单，肉眼不能直接看到，必须借助于显微镜才能观察到的微小生物。2、微生物的特点个体微小，分布广泛繁殖快速，易于培养种类繁多，代谢旺盛容易变异，适应力强3、微生物分类非细胞型微生物：无细胞结构，必须寄生于活得细胞内。如病毒原核细胞型微生物：无核膜和核仁，胞浆中缺乏完整的细胞器。包括细菌、放线菌、立克次体、支原体、螺旋体、衣原体真核细胞型微生物：有核膜核仁，胞浆中有完整的细胞器。如真菌。细菌的细胞形态、结构、繁殖方式和菌落特征1、细菌的细胞形态（菌落特征包含在里面）细菌的形态包括：细胞的大小、形状和排列状态。1）细胞大小度量细菌细胞大小的单位是微米，以“m”表示，即10-6m。细菌大小不一，典型细菌细胞的平均长度可用大肠杆菌（E.coli）来表示，其平均长2m，宽0.5m。2）细菌重量细菌的重量微乎其微，如果一个细胞的重量为10-12g，则约109个大肠杆菌细胞才能达到1 mg重。3）细菌的形状与排列状态细菌的形态十分简单，基本上有球状、杆状和螺旋状3种典型形状 球菌 呈球形或近似球形，根据细胞的分裂面和子细胞分离与否，有不同的排列状态，分单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌和葡萄球菌等。杆菌 细胞呈杆状或圆柱形。各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯曲。有的两端截平，如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)，有的略尖，如鼠疫巴斯德氏菌(Pasteurellapestis)，有的似栅栏状，如白喉杆菌。螺旋菌 如螺旋不满一环则称为弧菌，其菌体呈弧形或逗号状；满26环外形坚挺的称螺旋菌或螺菌；旋转周数在6环以上，柔软易曲的称螺旋体。在自然界存在的细菌中，杆菌最常见，球菌次之，而螺旋状最少。4）细菌的群体形态 在固体培养基上的群体形态a菌落（colony） 由单个细胞或少数细胞在固体培养基表面繁殖形成的肉眼可见的子细胞群体。单个微小的细菌用肉眼是看不到的，但当在固体培养基上生长、繁殖时产生的大量细胞，形成肉眼可见、具有一定形态、结构的子细胞群。b菌苔（lawn） 当一个固体培养基表面有许多菌落连成一片时，称菌苔。c菌落形态 其特征具有一定的稳定性和特殊性。这是检查菌种纯度、辨认和鉴定菌种的重要依据。但细菌菌落也受环境影响，故在进行菌种鉴定时要注意检测条件一致。细菌菌落的共同特征 湿润、粘稠、易挑起（菌体和基质结合不紧密），质地均匀、菌落各部位的颜色一致等。但不同细菌的菌落也具有自己特有特征，例 无鞭毛、不能运动的细菌。球菌菌落 常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌菌落 较大、扁平，边缘波状、锯齿状等；有荚膜 较大且表面光滑，无荚膜者则表面较粗糙。有芽孢 表面常有皱褶且很不透明。d纯种菌落 一个菌落可由单个或多个细胞繁殖而来。一个菌落是由一个细菌繁殖而来，就是一个纯种细胞群或称克隆（clone）。e应用 菌落已被广泛应用于菌种的分离、纯化、选育等方面，在基因工程中亦得到普遍的应用。细菌在液体培养中不能形成菌落，但使培养液混浊，或在液体表面形成膜，或产生絮状沉淀。菌落的描述大小 大、中、小、针尖状。（可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。干湿情况 干燥、湿润、粘稠。形态 圆形、不规则等。高度 扁平、隆起、凹下。透明程度 透明、半透明、不透明。边缘 整齐、不整齐。2、细菌的结构（1）细菌细胞的一般结构主要有细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成。1） 细胞壁（cell wall）是包在细胞表面最外层的、坚韧而略带弹性的薄膜。占菌体干重1025%，厚度1023nm。细胞壁上有许多小孔，是细胞内外物质交换的通道。除支原体外，几乎所有细菌都有细胞壁。主要功能 能使细胞保持固定形状，免受损伤。主要化学成分 肽聚糖、磷壁酸(酸性多糖)、脂多糖和表面蛋白。细菌的革兰氏染色 细菌的形体太小给研究者带来很大困难。1884年由丹麦医生C.Gram创建了一种极为方便的方法，可把几乎所有的细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，此法为革兰氏染色法。G染色过程结晶紫初染碘液媒染95%乙醇脱色沙黄等红色染料复染。G染色结果 G+被染成蓝紫色，G-被染成浅红色。G-细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质。 细胞壁的构造 G+细胞壁较厚（2025nm），只有肽聚糖层；而G-细胞壁虽然较薄（1015nm），却有多层构造肽聚糖和胞壁外层。另两者在表面结构上也有显著不同。结构革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌坚韧度较坚韧较疏松厚度较厚，20-80nm较薄，5-10nm肽聚糖层数及含量多，可达50层多，占细胞干重的50%-80%少，仅1-2层少，占细胞干重的10%-20%磷壁酸有无外膜（含脂多糖、脂质双层、脂蛋白）无有2）细胞膜（cell membrane）与其他生物一样，细菌细胞膜也是单位膜。紧贴细胞壁内层、包围细胞质的一层柔软而富有弹性的选择性的半透膜。平行的脂质双层，其间镶嵌多种蛋白质。电镜下有3层，两层暗的电子致密层中间夹着一层较亮的电子透明层，厚约78 nm。a主要功能 选择性控制营养物质以及代谢产物进出细胞。细胞膜是必不可少的部分。无细胞壁的支原体照样生活，如细胞膜受损，导致死亡。细胞膜功能：渗透屏障，维持细胞内正常的渗透压；物质运输；参与膜脂、细胞壁各种组分以及荚膜等的生物合成；参与产能代谢，在细菌中，电子传递链和ATP合成酶均位于细胞膜；分泌细胞壁和荚膜的成分（孔蛋白、脂蛋白、多糖）、胞外蛋白（各种毒索、细菌溶菌紊）以及胞外酶（青霉素酶、蛋白酶、淀粉酶等）；参与DNA 复制与子细菌的分离；提供鞭毛的着生位点。b主要化学成分 蛋白质（6070%,种类200种）、磷脂（3040%）和少量糖类。c质周间隙 革兰氏阴性菌细胞膜和细胞壁间的空隙，性质与功能尚未确定。3）细胞质是包裹在细胞膜内的除细胞核外的细胞物质，是细菌的基础物质，呈溶胶状态。细菌细胞质由流体部分（细胞溶质）和颗粒部分构成。主要成分 水、蛋白质、核酸、脂类，并含少量糖及无机盐。流体部分 可溶性酶类、RNA颗粒部分 核糖体、贮藏性颗粒、载色体、质粒主要功能 是细菌的基础物质，以颗粒状散布于细胞质中的核糖体是细胞合成蛋白质的场所。4）原核区（细胞核）细菌无真正的细胞核，没有核膜、核仁，没有固定形态，只是在菌体中央有一个大量遗传物质DNA所在的核区，结构简单。这是原核与真核生物的主要区别。主要成分 DNA主要功能 贮存和传递遗传特性。（2）、细菌细胞的特殊结构不同细菌在不同的生长环境或生长阶段还有一种或多种特殊结构。1）芽孢概念 许多G+杆菌在不利的环境条件下能在细胞内形成圆形、卵圆形或圆柱形的休眠体，称为芽孢。芽孢对干燥、辐射、高温和毒性物质等恶劣环境条件有很强抵抗力。多形成于细菌代谢旺盛的末期。种类 杆菌中只有两个属的细菌能够产生芽孢，好氧的芽孢杆菌和厌氧的梭状芽孢杆菌。形状与特征 不同菌种芽孢的大小、形状和位置不同。芽孢可生长在细胞的中央，也可在近一端或尖端生长，其大小可以大于细胞宽度，也可小于细胞宽度，因此芽孢显示出梭状、鼓槌状等不同形状。形成芽孢是细菌菌种的特征。数量 每个细菌一般只产生一个芽孢，故芽孢不是细菌的繁殖型。2）荚膜荚膜(capsule) 有些细菌在细胞壁外包绕一层粘液性物质，厚度超过0.2m，且边界明显者即为荚膜。这些物质，有时用负染色法可在光学显微镜下看见。荚膜具有保护细菌的作用；还具有抗干燥作用。 3）鞭毛主要是由蛋白质组成的细长丝状体，通过端部一个钩形的细胞器根植于细胞膜内。通过收缩推动细胞运动，使细菌可在水中游动。大小 所有弧菌、螺菌和假单胞菌，约半数杆菌和少数球菌有鞭毛。细菌鞭毛是一端连于细胞膜，一端游离的、细长的波形纤丝状，数目不一，从12根到数百根。鞭毛长320m，是菌体的数倍，但直径很细，仅1020nm，因此只有通过特殊的鞭毛染色，才能在普通显微镜下观察到。着生位置和数目 是细菌分类鉴定所依据的形态特征之一。种类 根据细菌鞭毛的特征，可分为单端单鞭毛、两端单鞭毛、偏端丛鞭毛、两端丛鞭毛和周生鞭毛。4）菌毛细菌表面遍布着比鞭毛纤细、短而直的丝状物，称为菌毛。与细菌运动无关，化学成分主要是蛋白质。1、 细菌的繁殖方式：主要以二分裂法，具体见大肠杆菌的分裂1、菌落形态 其特征具有一定的稳定性和特殊性。这是检查菌种纯度、辨认和鉴定菌种的重要依据。但细菌菌落也受环境影响，故在进行菌种鉴定时要注意检测条件一致。细菌菌落的共同特征 湿润、粘稠、易挑起（菌体和基质结合不紧密），质地均匀、菌落各部位的颜色一致等。但不同细菌的菌落也具有自己特有特征，例 无鞭毛、不能运动的细菌。球菌菌落 常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌菌落 较大、扁平，边缘波状、锯齿状等；有荚膜 较大且表面光滑，无荚膜者则表面较粗糙。有芽孢 表面常有皱褶且很不透明。2、纯种菌落 一个菌落可由单个或多个细胞繁殖而来。一个菌落是由一个细菌繁殖而来，就是一个纯种细胞群或称克隆（clone）。1、 3、菌落特征的描述：从形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等方面来描述。以下是描述菌落特征的常用术语：（1）颜色（colour）（正反面颜色）：细菌产生的色素一般有水溶性色素和脂溶性色素。肉眼观察可见，水溶性色素使培养基染上颜色，脂溶性色素只造成菌落本身出现颜色，培养基还是原来颜色。（2）边缘（edge）：整齐、波状锯齿状、丝状和羽毛状等。（3）溶血性（hemolysis）：当用新鲜的血平板培养某些细菌时，会看到菌落周围出现溶血现象。根据溶血能力的不同，可将其分为溶血（不完全溶血，草绿色半溶血环）、溶血（完全溶血，透明溶血环）和溶血（不溶血）三种类型。（4）形状（shape）：圆形、针尖状（直径小于1mm）、不规则。（5）大小（size）：以mm 计。（6）表面（surface）：光滑、粗糙、同心圆、放射状和乳突状等。（7）质地（texture）：粘性、蜡质、膜样和奶油样等。（8）厚度（thickness）：扁平、凸起和脐形。（9）透明度（transparency）：不透明、半透明和透明。（10）菌落类型：光滑型菌落（smooth colony），粗糙型菌落（rough colony）和粘液型（mucous colony）。革兰氏染色实验原理：细菌菌体极小，而且折光率低，在显微镜下不容易看清，如将它经过染色，使折光率增大就容易看清楚。此外由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不一样，因此，可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌。革兰氏染色法是细菌染色中一种很重要的鉴别染色法。细菌先经碱性染料着色，用媒染剂处理后，以脱色剂脱色，最后复染。若细菌仍保持原来的染料颜色，称为革兰氏阳性细菌。如被脱色剂脱色，染上了复染染料的颜色，则称为革兰氏阴性细菌。利用革兰氏染色法可将所有细菌区分为两大类。革兰氏染色程序：涂片干燥固定结晶紫染色水洗碘液媒染水洗吸干95酒精脱色水洗吸干番红复染水洗干燥镜检（1）涂片 先滴一滴生理盐水于干净载玻片上，然而用接种环取菌种少许与玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。（2）干燥 涂片最好在室温中让其自然干燥，有时为了使干燥得快些，也可在酒精灯上加温，但勿紧靠火焰。（3）固定 待涂片干燥后，持载玻片（将有标本面向上）在酒精灯火焰上通过几次，使涂片的菌体紧贴于载玻片上不易脱落，但固定时温度不宜过高，以玻片背面触及手背皮肤不觉烫为度。固定目的是杀死细胞以及改变对染色剂的通透性。（4）用草酸铵结晶紫染色1分钟后水洗。（5）加路哥氏碘液作用1分钟后水洗，吸干。（6）用95酒精褪色至滴加的酒精则不呈紫色为止。褪色时应将玻片微微摇动，使酒精分布均匀。这一步是革兰氏染色法的关键，必须严格掌握好酒精脱色度。如脱色过渡，则把阳性菌误认为阴性菌；如脱色不够，则把阴性菌误认为阳性菌。（7）水洗 斜置玻片用很细水流的自来水自染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷在涂片处，直至洗下的水里无色为止。（8）吸干 自然干燥或用洁净吸水纸覆盖玻片上吸干水分。（9）加0.5蕃红染色1030秒钟后水洗。（10）干燥。（11）镜检 置显微镜下，先用低倍镜观察，后用高倍镜（湍镜）观察。显微镜的使用：（一）显微镜的构造显微镜是一种高度放大的光学仪器。显微镜的种类很多，根据实验目的要求不同，可分别选用普通光学显微镜、相差显微镜、睹视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜及电子显微镜。用于微生物形态检查观察，以普通光学显微镜最为常用。普通光学显微镜，通常简称为显微镜。显微镜的构造，可分为光学和机械两大部分。显微镜的构造如图1-1所示。1、机械部分 主要包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、调焦装置和物镜转换器。镜座 是用来支持显微镜的，呈马蹄形，在显微镜的底部。座内装有反光镜或照明光源。镜臂 支撑镜筒及用于移动，呈圆弧形。有固定式和活动式两种。活动式镜臂可改变角度。一、管碟法1实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160干热灭菌2h后备用。2.培养基的配置与菌悬液的准备（1）牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂23g 水 1000mLpH 7476（2）金黄色葡萄球菌菌悬液的配置将接种了金黄色葡萄球菌的牛肉膏蛋白胨培养基在37下培养24-48h，制成菌悬液。3.注培养基 （1）加注底层培养基 无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证平板放置区域的平整。在平板底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。 试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到平板之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注6080的培养基底层之后，不应立即给平板加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在平板盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。（2）加注培养基菌层 制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50水浴锅内保温。试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动平板使培养基均匀铺开。（3）（另一种方法）a.在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌涂布棒将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）b.菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10 nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37培养8-18小时，观察结果。4. 放置小钢管 放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与平板边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在平板的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照平板底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。5. 滴加抗生素溶液滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。6.菌株的培养 滴加了抗生素溶液后的平板忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把平板与玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。平板在37下培养约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一平板上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把平板放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，平板叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。7. 抑菌圈测量 在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在37培养1618小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。(1)试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在1822mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。 (2)用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在平板底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把平板翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。8.讨论 试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。因此抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作规范，才可以得到准确的检测结果。准确测定抗生素效价，对评价抗生素的治疗效果，指导临床应用都有着重要意义。二、离心机1、离心原理        当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。       此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。       离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力（F）的大小取决于离心转头的角速度（，r/min）和物质颗粒距离心轴的距离（r，cm）。它们的关系是：F2R为方便起见，F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g （约等于9.8m/s2.）得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。例如离心机转头平均半径是6cm，当转速是60 000r/min时，离心力是240 000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。2、 超速离心机的离心方法       用离心方法分离生物大分子和亚细胞物质的基本原理是根据它们在液体介质中或者沉降速度不同而形成不同的区带，或者它们的密度不同而停留在液体介质中不同的位置而把它们一一分开。前者是沉降速度法，应用该法时液体介质的最大密度要小于样品中最小颗粒的密度，离心时选用高转速和短时间；后者是沉降平衡法，应用该法时液体介质的最大密度要大于样品中最小颗粒的密度，离心时选用较低转速和较长时间。实际操作有几种形式：       1.差速离心 这种方法是选择不同转速的离心，分别分离各个不同组分。例如先用低速沉降大颗粒和上清液，在高速离心上清沉降中等颗粒，最后超速离心上清沉降小颗粒。采用逐级提高离心力分离上情液的方法，把不同大小的颗粒分开。        这种方法比较简单，方便。分离的组份沉到管底，因此可以迅速浓缩所要的组份，减少体积。但回收率和纯度是有矛盾的，要提高回收率，势必提高转速或延长离心时间，这样大小相近的颗粒也会沉到管底。因此该法多用于粗提纯或初步浓缩样品。        2.速度区带（或速度梯度）离心 本法是将样品放在一个连续的密度梯度液体上，通过离心，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢。经过一段时间，相同的颗粒就在同一深度形成一条带子，因此把各种组份分开来。它适用于分离密度相同、而大小不同的物质，如不同的蛋白质组份密度都差不多，但分子量不一样，用本法很容易将其分开。但对密度不同、大小类似的物质则不易分离。       蔗糖梯度是一种常用的介质。用不同浓度的蔗糖溶液（5%-60%）配成梯度，用于梯度离心。再分别进行收集处于不同区带里的各个组份。糖发酵试验原理： 微生物具有不同的利用各种碳源的能力，其原理在于不同微生物具有不同的酶系。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。 溴甲酚紫（pH5.2黄色6.8紫色）是一种酸碱指示剂，在中性时为紫色，碱性时为深红色，而在酸性时呈现黄 色。微生物在进行碳源代谢时可以产生不同的代谢产物，有些产物为酸性物质。酸性物质的积累有时会超出培养基的缓冲范围，导致ph下降，溴甲酚紫的颜色由紫色转为黄色。在产酸过程中有时会伴随气体的产生，这可以在杜氏管中的气泡反应出来。若碳源代谢的终产物为中性化合物，既无颜色变化也无气体产生，表明此时的代谢较为复杂。微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察 、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。(见图3-1) 34 35 36 37图3-1 细菌的菌落特征1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。二、生理生化试验微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。微生物检验中常用的生化反应有：、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。、淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。试验方法：以1824h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养2448h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。3、V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。试验方法：1）O'Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h,培养液1ml加O'Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml,摇动试管12min,静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在4850°C水浴放置2h后判定结果者。2）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°C萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动25min,阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。3）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。4、甲基红（Methyl Red）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml,加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.46.0,其pK值为5.0.故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。5、靛基质（Imdole）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。6、硝酸盐（Nitrate）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。试验方法：临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（-萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。用-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。7、明胶（Gelatin）液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取1824h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于36±1。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，1020min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。8、尿素酶（Urease）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0.试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。9、氧化酶（Oxidase）试验氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。10、硫化氢（H2S）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1培养2428h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1培养16天。纸条变黑为阳性。11、三糖铁（TSI）琼脂试验试验方法：以接种针挑取待