微生物复习重点.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物复习重点.精品文档.微生物复习重点一、细菌与酵母菌细胞壁化学组成及结构特点细菌细胞壁：革兰氏阳性菌：革兰氏阳性菌细胞壁特点是厚度大和化学成分简单，一般含90%肽聚糖和10%磷壁酸，肽聚糖分子由肽和聚糖组成，聚糖是由N乙酰葡糖胺和N乙酰胞壁酸两种单糖以1,4糖苷键连接而成的长链。肽包括四肽尾和肽桥，四肽尾是由4个氨基酸分子按L型和D型交替方式连接而成，肽桥变化甚多。革兰氏阴性菌：革兰氏阴性菌细胞壁的特点是厚度较G+细菌薄，层次较多成分复杂，肽聚糖层很薄故机械强度较G+细菌弱。G肽聚糖层埋藏在外膜脂多糖层内，其肽聚糖单体结构与G+基本相同，差别在于四肽尾第三个氨基酸分子不是LLys而被只存在于原核生物细胞壁上的mDAP代替。没有特殊的肽桥仅通过前一个四肽尾的第四个氨基酸（DAla）的羧基与后一个四肽尾的第三个氨基酸（mDAP）直接相连，因而只形成较稀疏机械强度较差的肽聚糖网套。外膜为G特有结构，化学成分为脂多糖、磷脂、和若干外膜蛋白。脂多糖由类脂A、核心多糖、O特异侧链组成，其中类脂A是G病原菌内毒素的物质基础。G细菌外膜与细胞膜之间狭窄胶质空间为周质空间，存在多种周质蛋白包括水解酶类、合成酶类、运输蛋白等。酵母菌细胞壁：“三明治状”外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，都是分枝状聚合物，中间夹着一层蛋白质，包括多种酶如葡聚糖酶、甘露聚糖酶，葡聚糖是赋予细胞壁以机械强度的主要成分，芽痕周围有少量几丁质成分。二、细菌细胞壁的组成结构与革兰氏染色之间的关系，怎样保证结果准确通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物，G+细菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密故遇脱色剂（乙醇）处理时因失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物留在壁内，使其保持紫色。G细菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄和交联度差，遇到乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解这时薄而松散的肽聚糖层不能阻挡结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色。在经过蕃红染料复染时，就使G细菌成红色而G+仍保留最初的紫色。如何保证准确：1、控制菌龄，革兰氏染色要求菌种处于活跃生长，一般不超过24小时否则影响实验结果。2、操作规范，严格按照实验流程3、与标准菌混合染色，对比试验结果。三、T偶数噬菌体繁殖过程吸附：游离的噬菌体与宿主相遇，尾丝与宿主表面受体接触，以刺突和基板固着在宿主体表。侵入：尾丝收缩尾丝收缩，尾管端的溶菌酶水解宿主细胞壁，将核酸注入宿主细胞。增殖：利用宿主代谢系统合成大量噬菌体核酸、蛋白质和酶类。成熟：噬菌体DNA分子缩合，头的亚单位被组装成头部，尾和尾丝也各自组成然后按从头到尾的顺序自我装配，形成完整噬菌体。释放：宿主细胞经酯酶和溶菌酶等水解后裂解，释放出一群成熟的子代噬菌体。（一步生长曲线）四、人工控制生物代谢三种方法（代谢调控）（1）营养缺陷型突变：营养缺陷型突变属于遗传性代谢障碍，往往是由于结构基因的突变导致合成代谢途径中某一酶的缺失或失活，从而使代谢途径中断。表现为菌株丧失合成某种物质的能力，必须在培养基中补加该物质，否则菌株不生长的现象。突变位置不同：1、解除正常代谢的反馈调节：这类突变株是由于代谢途径中断造成末端产物不能合成从而解除反馈调节，使中断前的代谢产物或其他代谢途径终产物大量积累。渗漏性缺陷型是特殊的营养缺陷型，由于造成酶活性下降而非完全丧失，属于遗传代谢障碍不完全突变，由于少量合成代谢产物又不会造成反馈抑制，不需要限量添加营养因子。2、控制细胞膜的透性：这类突变涉及微生物细胞膜的组成，可对突变株控制外在培养条件，来改变细胞膜的透性从而影响胞内物质的运输和分泌，使胞内代谢产物不会形成高浓度积累解除了反馈调节。通过细胞膜缺失突变控制透性分为直接影响磷脂的生物合成和间接影响磷脂的生物合成两种。通过细胞壁的缺失突变控制透性，位于细胞膜外的细胞壁结构，特别是骨架结构如果出现部分破坏或变形会间接影响到膜的通透性。（2）营养缺陷回复突变：指突变基因个体再通过突变又成为野生型表型的过程，由于调节酶具有两个独立的亚基结构，与底物结合的催化亚基以及能与效应物结合的调节亚基，若回复突变发生在催化亚基上使催化亚基恢复活性，而调节亚基仍没有活性，可以从根本上解除反馈调节。（3）结构类似物抗性突变：变构酶的结构基因或者编码阻遏蛋白的调节基因发生突变，使变构酶或者阻遏蛋白不能与结构类似物结合，此时无论是代谢终产物还是结构类似物对变构酶或阻遏蛋白都丧失了反馈调节作用，从而导致代谢终产物大量合成，从根本上解除了反馈调节。应注意的是，选育获得结构类似物抗性突变株不一定都是解除了反馈调节的突变株，有些是结构类似物能被代谢解毒或者细胞膜对结构类似物透性异常造成的。五、自然界获得某一高产菌株的一般步骤1、调查研究及查阅资料2、设计实验方案3、确定采样的生态系统采集菌种4、确定增殖培养的条件增殖培养（产芽孢菌的分离应先进行80 10min热处理后增殖培养）5、确定特殊的选择培养基，及可能的定性或定量快速检出法分离纯化6、性能鉴定：初筛；复筛加工蜜饯，糖果，蜂蜜土壤中易得到利用糖质原料的耐高渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌。食品加工厂，粮食加工场，饭店，日常接触淀粉较多的污水沟的污泥以及水沟旁的土壤易得到以淀粉质原料为碳源的氨基酸产生菌，淀粉酶产生菌。森林中腐叶烂草下面的土壤，分离得到纤维素酶产生菌。加工皮革的生皮晒场，蚕丝，豆饼等腐烂变质处土壤分离得到蛋白酶产生菌。油田，炼油厂的浸油土壤中分离得到降解和利用石蜡，芳香烃，烷烃的微生物。高渗酵母采用40%葡萄糖的培养基pH2.04.0；产柠檬酸黑曲霉采用90%甘薯粉醪和10%柠檬酸pH2.02.5；分离放线菌采用可溶性淀粉为唯一碳源pH7.07.2若加入葡萄糖细菌就会大量繁殖采样影响因素：由于光照，水分，通风，养分等原因，一般取离表层515CM深处的土壤，秋季温度对微生物生长繁殖最适，避免雨季采集，不同微生物对土壤酸碱度的不同喜好，取样后记录采样时间，地点，环境情况等以备查，并尽快分离防止微生物大量死亡。增殖培养：1、控制培养成分根据各种微生物对营养要求差异控制营养成分达到对目的菌浓缩的效果。2、控制培养基酸碱度细菌和放线菌中性或偏碱，酵母菌霉菌一般偏酸，控制pH有利于促进目的菌增殖控制非目的菌繁殖。3、热处理根据芽孢和营养细胞对热耐受性差异淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物（80 10min）4、增加抑制剂如增殖放线菌时，加10%酚数滴可抑制霉菌和细菌生长，添加抗生素抑制非目的菌生长。5、控制培养温度由于发酵产热要求菌种耐高温，分离时可适当提高培养温度。纯种分离：涂布平板法：样品经无菌生理盐水稀释后用玻璃涂布棒均匀涂布至琼脂培养基表面，表面形成单菌落。倾注平板法：将无菌生理盐水稀释后的样品加入无菌培养基混合均匀，待凝固后倒置培养，内部及表面形成单菌落。平板划线法：用接种环蘸取少量样品或样品稀释液，在琼脂平板上分区进行划线，培养后得到呈分散状态的单菌落。细菌酵母菌每平板100200菌落为佳；丝状菌控制每平板3050或更少，可以加0.1%左右去氧胆酸钠或山梨糖防止菌丝蔓延，便于挑取。组织分离法：适用于从子实体或罹病植株上分离真菌或植物致病菌，切取小块受病组织，用10%漂白粉水或0.1%升汞进行表面消毒并用无菌水洗涤数次后移置于培养皿中的琼脂培养基表面培养。平板反应快速检出法：1、纸片培养显色法：以饱浸某种指示剂的固体培养基滤纸搁置于培养皿中，用牛津杯架空，下方小团浸有3%甘油的脱脂棉保湿，用接种环将适量细胞悬液接于滤纸上，保湿培养得到分散单菌落，菌落周围形成对应颜色变化，指示剂变色圈与菌落直径之比值大者产物产量高，指示剂可以是酸碱或能与产物反应产生有色物质的其他指示剂。2、透明圈法：利用混浊的底物被分解后形成透明圈的大小检出微生物分解利用此物质的能力。可溶性淀粉常温下不产生混浊，低温环境下溶解度急剧下降产生混浊，培养基中加入可溶性淀粉待单菌落形成后，将平板置于冰箱过夜，形成透明圈。粉末碳酸钙和酪素检出有机酸或蛋白酶产生菌。3、变色圈法：直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，根据显色圈或变色圈的形成检出目的菌。淀粉酶选用稀碘液，刚果红与葡聚糖，羟甲基几丁质结合呈红色。检出葡聚糖酶，几丁质酶。4、生长圈法：根据工具菌在目的菌周围形成的生长圈对目的菌检出的方法。工具菌一般为某生长因子营养缺陷型，目的菌能在缺乏该生长因子的琼脂培养基上生长并分泌该生长因子或生长后分泌的某种酶能使前体转化成该生长因子，经培养后工具菌就会在目的菌周围形成生长圈。常用检出氨基酸，核苷酸，维生素产生菌。5、抑菌圈法：根据工具菌在目的菌周围生长被抑制形成的抑菌圈对目的菌检出。目的菌在生长过程中能分泌抗生物质或某种酶将无抑菌作用的前体物质转化为抗生物质而工具菌则为对该抗生物质敏感的菌株，由于微生物生长晚期才能分泌抗生物质故培养时间较长，各菌产生抗生物质会相互干扰，所以要分两步进行，先不加工具菌对样品纯种分离形成菌落后将菌落与周围小块琼脂取出置于另一无菌培养皿保温培养45天，使抗生物质在小块琼脂中积累，然后转移到涂有工具菌的鉴定平板保持小块间距2CM，过夜培养后观察抑菌圈，抑菌圈大小反应琼脂块内抗生物质浓度高低，用于抗生素产生菌的检出。厌氧微生物分离：培养基中加入还原剂；加入忍天青等氧化还原指示剂1、分离琼脂技术：45左右含有还原剂琼脂培养基与待分离样品稀释液混合均匀后加入直径1CM无菌长玻璃管，凝固后两端用橡皮塞封闭，经培养后观察单菌落，用锉刀将玻璃管锯断进行转接，用于白酒发酵窖泥中分离增香微生物乙酸梭菌。2、厌氧罐技术：内源性产气袋，产二氧化碳，氢气，钯催化氢气氧气反应。3、厌氧手套箱技术筛选：初筛以量为主（1株1瓶），复筛以质为主（每株35瓶），复筛可反复进行多次直至选出13个菌株。六、微生物间相互关系互生：两种可单独生活的微生物共存于同一环境时，互为对方提供营养或创造良好生活条件，可分可合，合比分好的互利互惠关系。例子：混菌发酵；好氧性自生固氮菌与纤维素分解菌，后者分解纤维素产生有机酸可为前者提供固氮时营养，前者向后者提供氮素营养物；二步发酵生产维生素C共生：两种生物共局在一起，相互依赖，彼此有利，甚至形成特殊的共生体，它们在生理上表现出一定分工，在组织和形态上产生了新的结构，相依为命的关系。例子：废水处理甲烷菌（产氢产乙酸菌群）寄生：一种微生物生活在另一种微生物的体内或体外，依靠摄取后者细胞的营养生长和繁殖，并使之遭受损害甚至死亡。损人利己的关系。例子：噬菌体噬菌体防治措施：防重于治；不用可疑菌种；严格保持环境卫生；不排放、丢弃生产菌液；采用高空优质空气；加强罐体和管道灭菌；不断筛选和使用抗噬菌体菌种。拮抗：两种微生物生活在一起，其中一种能产生某种特殊的代谢产物或改变环境条件，从而抑制或杀死另一种微生物，排除异己的关系。例子：青霉素发酵竞争：生活在一起的两种微生物，为了生长争夺有限的同一营养或其他共同需要的生长条件而相互竞争，互相受到不利影响，明争暗斗的关系。例子：发酵工业中杂菌的污染。七、微生物从环境中吸收营养物质的各种方式（跨膜运输方式）简单扩散：指疏水性双分子层细胞膜在无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式，让许多小分子，非电离分子尤其是亲水性分子被动通过的一种物质运送方式。促进扩散：溶质在运送过程中，必须借助存在于细胞膜上的底物特异性载体蛋白的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式。简单主动运输：一类须提供能量，并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象变化而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。基团移位：被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变，以被修饰的形式进入细胞质的输送机制。（大肠杆菌运送葡萄糖）比较项目简单扩散促进扩散简单主动运输基团移位特异载体蛋白无有有有运送速度慢快快快溶质运送方向由浓至稀由浓至稀由稀至浓由稀至浓平衡时内外浓度内外相等内外相等内部浓度高得多内部浓度高得多运送分子无特异性特异性特异性特异性能量消耗不需要不需要需要需要运送前后溶质分子不变不变不变改变载体饱和效应无有有有与溶质类似物无竞争性有竞争性有竞争性有竞争性运送抑制剂无有有有运送对象举例H2O、CO2、O2、甘油、乙醇、少数氨基酸、盐类、代谢抑制剂，、糖（真核生物）氨基酸、乳糖等糖类、Na+、Ca2+、等无机离子葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等八、温度、氧气、pH、渗透压、表面张力、水活度对微生物的影响，氧对厌氧微生物的毒害机理温度：温度通过影响微生物细胞膜的液晶结构，酶和蛋白质的合成和活性、RNA结构及转录等影响微生物生命活动。一方面随着环境温度上升细胞内生物化学反应速率加快，生长速率逐渐加强直到达到最大生长速率为止，另一方面温度继续上升，细胞中对温度较敏感的组分物质受到不可逆转的破坏生长速率迅速下降。最低生长温度、最高生长温度、最适生长温度（生长速率最高时的培养温度，对同一微生物来说最适生长温度并非一切生理过程的最适温度）嗜冷微生物：最适生长温度为15或更低，最高生长温度低于20耐冷微生物：能在0下缓慢生长，最适生长温度2040的微生物嗜温微生物：最适生长温度在2040微生物嗜热微生物：最适生长温度一般在5060的微生物极端嗜热微生物：最适生长温度在80以上的微生物极端温度是指低于微生物的最低生长温度和高于最高生长温度的温度氧气：专性好氧微生物：氧作为最终电子受体，并参与体内甾醇和不饱和脂肪酸的生物合成，具有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。兼性好氧微生物：在有氧和无氧条件下都能生长但有氧时生长更好，有氧时靠有氧呼吸产能，无氧时则能通过发酵或无氧呼吸产能，而且不需要分子氧参与进行生物合成，具有SOD和过氧化氢酶。微好氧微生物：需要氧，以氧作为最终电子受体，但只能在较低氧分压下才能正常生长。具有SOD和过氧化氢酶。耐氧厌氧微生物：可在分子氧存在下进行发酵产能的微生物，它们生长不需要氧，但分子氧对它们无害，具有SOD和过氧化物酶缺乏过氧化氢酶。专性厌氧微生物：生长不仅不需要氧，而且分子氧对它们有毒害作用，细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶大多数还缺乏过氧化氢酶。毒害机理：生物体内超氧阴离子自由基普遍存在，它是活性氧的形式之一，既有分子氧的性质又有离子性质，其性质极不稳定化学反应力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构还可形成其他活性氧化物，由于专性厌氧微生物缺乏SOD，不能使超氧阴离子自由基歧化成过氧化氢因此分子氧时细胞就受到超氧阴离子自由基的毒害。pH值：改变细胞膜所带电荷状态，从而影响细胞对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变环境中营养物质的可给性；改变环境中有害物质的毒性渗透压：等渗溶液：微生物正常生长；低渗溶液：细胞吸水膨胀，甚至胀破；高渗溶液：细胞脱水，影响代谢活动，引起质壁分离，甚至死亡。表面张力：低表面张力，微生物在液体中均匀生长。高表面张力，微生物在液体表面形成菌膜。改变表面张力的方法：升高表面张力：添加无机盐；降低表面张力：添加表面活性剂水活度：表示环境中微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，水是细胞组成成分，还起着溶剂和运输介质的作用，参与细胞内水解、氧化、还原等反应。辐射：紫外线能使DNA分子形成嘧啶二聚体，复制时造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物死亡或变异，紫外还可以是空气中的分子氧变成臭氧，臭氧有杀菌作用。电离辐射，射线间接地通过引起水及其他物质的电离形成自由基，自由基与生物大分子物质反应并使之失活。作用于氧气分子，产生的强氧化性基 团，氧化细胞中的蛋白质和酶分子的巯基， 而使细胞受到损伤或死亡。九、微生物营养物质种类及作用1、水：水是细胞组成成分，以水中的H2还原CO2合成糖；一切营养物或代谢产物的优良溶剂和运输介质；维持生物大分子的结构稳定性和细胞正常形态；参与某些生化反应；为生物生存提供优良环境。2、碳源：满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物质，以无机碳源作为主要碳源的微生物为自养微生物，必须利用有机碳源的为异样微生物。为一切微生物细胞提供有机物的碳架；为微生物提供能源和H、O来源。3、氮源：提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养物质，为一切微生物细胞中的含氮有机物提供氮元素；必要时可作为异样微生物的能源；少数化能自养微生物可利用NH3等无机氮源作能源。4、无机盐类：为微生物生长提供除碳元素以外的各种重要元素，构成酶或菌绿素等的活性中心；稳定生物大分子活细胞结构；调节渗透压、pH和氧化还原电位；某些化能自养微生物的能源；细胞内重要分子的成分；酶的激活剂；无氧呼吸时的氢受体。5、生长因子：调节微生物正常代谢所必需的但不能用简单的碳源氮源自行合成的有机物，作为酶的辅基或辅酶；提供微生物不能合成的成分。生长因子自养型微生物：不需要从外界吸收任何生长因子，多数真菌、放线菌和不少细菌。生长因子异样型：需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长。6、能源：为一切微生物的生命活动提供能源。十、微生物命名法则，举例。双名法：学名= + 大肠杆菌：Escherichia coli ( Migula ) Castellani et Chalmers 1919三名法：学名= + + 酿酒酵母椭圆变种Saccharomyces cerevisiae ( var ) ellipsoideus十一、微生物生长曲线各期特点，产生原因，影响因素及应用。停滞期：特性：菌体内物质量显著增长，菌体体积增大或伸长，代谢机能非常活跃，为适应环境可能产生特异的酶，生长速度逐渐加快，对外界理化因素因子抵抗力减弱。影响：菌种：不同菌种停滞期长短不同。菌龄：用对数期的菌种接种能缩短停滞期。接种量：接种量大小影响停滞期长短，一般接种量大停滞期短。培养基成分：接种到营养成分丰富的天然培养基中要比接种到营养单调的组合培养基中的停滞期短，此外培养基成分与微生物生长的培养及成分越接近停滞期越短。对数期：经过对新环境的适应阶段后，细胞生长旺盛以几何级数增长。特性：细胞生长速率最大，酶系活跃代谢旺盛，前期的细胞对理化因素仍较敏感，且菌体大小均匀，单个存在细胞占多数，生理特性较一致，细胞各成分平衡增长生长速率恒定。影响：菌种：不同菌种代时差别大。营养成分：同一种微生物在营养丰富的培养基上生长，其代时较短。营养物浓度：即可影响微生物生长速率又可影响生长总量。处于较低浓度范围可影响生长速率和菌体产量的某营养物称为生长限制因子培养温度：温度对微生物的生长速率有明显影响。应用：增殖噬菌体最适宿主；代谢、生理等研究的良好材料；发酵工业中做种子最佳材料。稳定期：产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物比例失调；酸醇毒素等有害代谢产物的积累；pH、氧化还原电势等物理化学条件越来越不适宜。特性：新增殖的细胞与衰亡细胞数相等；菌体产量达到最高点；细胞分裂速率降低；不少代谢产物特别是次级代谢产物大量合成，大多产芽孢细菌开始产生芽孢。应用：稳定期积累大量代谢产物是发酵工业产物收获的最佳时期，对维生素、碱基、氨基酸等生物测定的最佳测定时期。影响因素：因菌种和培养条件而异衰亡期：特性：微生物个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负增长，细胞形态发生变化，细胞本身所产生的酶和代谢产物作用使菌体分解死亡影响因素：取决于微生物本身遗传性能及环境条件。十二、微生物生长测定方法。测量生长量直接法：称干重：菌液经离心或过滤后烘干，称重。量体积：把菌液倒入刻度离心管中，经离心或自然沉降后计量。间接法：比浊法：细胞悬浮液的浑浊度通常采用波长为600700nm的分光光度计测定。（McFarland比浊管法用肉眼比较菌液与不同浓度硫酸钡悬浮液的浑浊度）适用于单细胞微生物，培养基中不含不容物，避免培养基颜色变化对比浊的影响。生理指标法：1、测菌液含氮量、含磷量、DNA、RNA、ATP或特殊化学成分。 2、测菌液产酸、产气、产热、耗氧或其黏度等。计繁殖数：直接法：计总菌数：借计数板在显微镜下直接计出细菌总数。计活菌数：采用美蓝等活菌染料在显微镜下直接计数。适用于单细胞微生物或单孢子悬液。间接法：平板菌落计数法：通过浇注或涂布平板法对试样做稀释培养后数出长在平板上的菌落数。适用单细胞或单孢子菌悬液。液体试管稀释法：MPN法，通过试管连续稀释试样，根据培养后的长菌情况查找MPN表后再计算含菌量。十三、什么是菌种衰退，菌种衰退原因，防治措施，及复壮方法。菌种的衰退是发生在微生物细胞群中一个由量变到质变的演化过程，主要原因是有关基因的负突变。开始时，在一个群体中只有个别细胞发生自发突变（一般为负突变）如果这个负突变个体的生长速率大于正常细胞，则随着不断地传代中，群中负突变细胞所占的比例就会逐步增大，最后发展成为优势群，从而使整个群体表现出严重的退化衰退原因：主要是有关基因的负突变；传代次数是加速退化的一个重要原因；不适宜的培养条件是加速退化的另一重要原因。防治措施：1、控制传代次数，尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。2、创造良好的培养条件，实践发现创造适合于原种的培养条件，可在一定程度上防止退化。3、利用不易衰退的细胞传代，在放线菌和霉菌中，由于菌丝体常为多核细胞，甚至是异核体，因此若用菌丝体接种就容易发生分离甚至退化，而孢子一般为单核的，用于接种可保持性状稳定。4、采用有效的菌种保藏方法，对于工业微生物生产菌种，采用有针对性的保藏方法可延缓退化的发生。复壮：狭义复壮指在菌种已经发生退化的情况下通过纯种分离和筛选从已经退化的群体中筛出尚未退化的个体，以达到回复原菌株固有性状的措施。广义复壮指菌种在典型特征或生产性状尚未退化前，经常有意识地进行纯种分离和筛选，以期从中选择到自发的正突变个体。复壮方法：纯种分离，涂布平板、平板划线等；通过宿主体内生长进行复壮（寄生菌或噬菌体）；淘汰已退化的个体。十四、溶源性细菌概念及特点温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，由于噬菌体的基因组整合到宿主细胞的基因组上，并随宿主基因组的复制而进行同步复制，并不引起宿主细胞裂解，宿主就称溶源性细菌。特点：1、能与温和噬菌体长期共存2、经自发或诱导后可发生裂解3、对同种噬菌体有免疫性4、可进入溶源循环十五、菌种保藏的方法及适用对象方法主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）低温（4）各大类约16月简便冰箱保藏法（半固体）低温（4），避氧细菌，酵母菌约612月简便石蜡油封藏法低温（4），阻氧各大类（不适用与能同化烃类菌）约12年简便砂土保藏法干燥，无营养产孢子的微生物约110年简便有效甘油悬液保藏法低温（70），保护剂（15%50%甘油）细菌，酵母菌约10年较简便冷冻干燥保藏法干燥，低温，无氧，有保护剂各大类510年繁而高效液氮保藏法超低温（196），有保护剂各大类15年繁而高效十六、微生物营养类型光能自养型：具有光和色素，既能通过光和磷酸化作用产生ATP又能以还原性无机化合物（如H2S）为电子受体，还原CO2合成细胞物质。光能异养型：能够利用光能但必须以外源有机化合物作为主要碳源和电子受体，人工培养时还需要提供生长因子。化能自养型：能利用无机化合物（NH3、NO2、H2、H2S）氧化时释放的能量，把主要碳源CO2中的碳还原或细胞有机碳架中的碳。化能异养型：以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中氧化磷酸化提供的ATP生长。营养类型能源氢供体基本碳源实例光能自养型光无机物CO2蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能异样型光有机物CO2及简单有机物红螺菌科的细菌（即紫色无硫细菌）化能自养型无机物无机物CO2硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌、硫磺细菌化能异养型有机物有机物有机物绝大多数细菌和除藻类以外的真核微生物十七、转导育种原理，转导噬菌体及转导子形成机制通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小段DNA携带到受体细胞中通过交换整合，使受体菌获得供体菌的部分遗传性状，由转导作用而获得部分新性状的重组细胞称为转导子。普遍性转导噬菌体：当烈性噬菌体感染供体菌或溶源性供体菌被诱导，在供体菌内的噬菌体进入营养期，在噬菌体DNA大量复制的同时，供体菌染色体DNA被核酸酶水解成小片段。在噬菌体成熟阶段，绝大多数噬菌体蛋白外壳包装的是噬菌体DNA，但偶然会发生将寄主染色体DNA片段错误进行包装，形成普遍转导噬菌体。转导子：由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，通过双交换而整合到染色体组上，从而使受体菌成为一个遗传性状稳定地重组菌，若这段外源DNA在受体菌内既不进行交换、整合和复制也不迅速消失，而仅表现稳定地转录、转译和性状表达，称为流产转导。受体菌进行细胞分裂这段外源DNA只分配到一个子细胞中，所以培养后只有一个细胞形成的菌落是转导子。局限转导噬菌体：溶源性细菌被诱导后噬菌体DNA从原整合处切离，形成一个完整的噬菌体基因组，但会发生非常低频率的不正确切离，使与噬菌体DNA相邻的染色体DNA一起切离，同时一段噬菌体DNA留在染色体上，切离的噬菌体DNA正常复制与包装成噬菌体颗粒形成局限转导噬菌体。（只能通过诱导溶源性细菌得到，只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为整合位点两侧的基因）转导子：转导噬菌体感染受体菌后遗传物质有三种去向：转导噬菌体进入裂解周期而产生子代转导噬菌体；转导噬菌体发生溶源化反应将其DNA整合到受体菌染色体上形成部分二倍体遗传上不稳定；转导噬菌体DNA与受体DNA之间发生重组，遗传上非常稳定约占总转导子的三分之一。十八、消毒和灭菌的区别，常用灭菌方法原理，优缺点适用对象，工厂连续灭菌利弊灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死能引起感染的微生物而对被消毒的对象基本无害的措施。1） 高温灭菌：高温使微生物蛋白质变性凝固从而引起微生物死亡。（1）干热灭菌法：1、灼烧：最彻底的干热灭菌法，破坏力极强仅限于接种环、接种针、金属小工具、试管口、三角瓶口等2、不宜直接用火焰灭菌的物品可放入干燥箱内进行热空气灭菌150170，12h。若处理物品传热较差应适当延长时间。适用于玻璃、陶瓷器皿、金属工具等耐高温物品，优点是灭菌后物品时干燥的。（2）湿热灭菌法：指用100以上的加压蒸汽进行灭菌，同样温度和相同作用时间下，湿热灭菌法比干热灭菌法更有效，原因是湿热蒸汽不但透射力强而且细胞原生质在含水量高的情况下易变性凝固，此外蒸汽在被灭菌物体表面凝结放出大量汽化潜热使被灭菌物体表面迅速升温，缩短灭菌过程。1、常压法：巴氏消毒法：专用于牛奶啤酒果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料灭菌，可杀灭物料中的无芽孢病原菌，又不影响原有风味，是一种低温湿热消毒法，一般6365，30min，高温瞬时消毒法72，15s煮沸消毒法：采用100下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水消毒。间歇灭菌法：适用于不耐热培养基灭菌如某些糖、明胶、牛奶培养基，80100，蒸煮，1560min。以杀死其中所有微生物营养体室温放置过夜，使其中芽孢发芽第二天以同样方法蒸煮和保存过夜，连续重复三天，可达到彻底灭菌，此法麻烦费时。2、加压法：高压蒸汽灭菌法：适用于金属、纤维、玻璃和陶瓷等制品，以及生理盐水、培养基、耐高温药品及其他，一般0.1Mpa，121，1530min，操作简便效果可靠广泛使用，有时为防止培养基内葡萄糖等成分被破坏也采用115下35min的方法。实罐灭菌法和连续灭菌法：实罐灭菌是在发酵罐中就地进行，将配制好的培养基放入发酵罐中通入蒸汽加热至灭菌温度维持一定时间后再冷却无需专门的灭菌设备，效果可靠对灭菌蒸汽要求低，但由于灭菌温度低时间长对培养基成分破坏较大，工业中难以实现自动控制。连续灭菌适用于大型发酵厂的大批培养基灭菌一般135140，515s。连续灭菌法优缺点：优点是连续性强，快速灭菌消毒培养基营养成分破坏少，适用于大容积发酵罐物料的连续灭菌，加热时间短提高了热利用率，操作条件恒定，灭菌质量稳定，易于实现管道化和自控操作，发酵设备利用率高。缺点是对设备要求较高，需另外设置加热、冷却装置，操作较麻烦染菌机会较多，染菌涉及面广不适合于含大量物体物料的灭菌对蒸汽要求高。影响加压蒸汽灭菌效果的影响因素：1、灭菌物体含菌量，含菌量高灭菌时间长。2、灭菌锅内空气排除程度，混有空气的蒸汽与纯蒸汽相比其压力与温度的关系很不相同，灭菌锅是靠蒸汽温度而不是单纯靠压力达到灭菌效果的。3、灭菌对象的pH，灭菌对象的pH6时微生物易死亡，pH在68时不易死亡。4、灭菌对象的体积，灭菌对象的体积大小影响热传导速率和热容量会明显影响灭菌效果。5、加热与散热速度、影响培养基破坏程度从而影响实验准确性和重复性。检验是否排净空气的方法：1、灭菌锅上同时装压力表和温度计2、将待测气体引入深层冷水中只听到扑扑声而无气泡冒出则已排净3、灭菌锅内加入耐热性芽孢杆菌（嗜热脂肪芽孢杆菌）灭菌后取出培养，视其是否生长即可知道灭菌温度是否达到4、加入适当熔点的固体试剂，经灭菌后看其是否熔化。2）过滤除菌对蛋白质、酶、血清和维生素等热敏性物质采用过滤除菌，但无法出去液体中的病毒和噬菌体。3）辐射灭菌，使微生物蛋白质核算等变性。紫外多用于物体表面、空气和一些与水一样不吸收紫外线物质的表面消毒，不能穿透固体、不透明体和能吸光的表面，适用于不耐热或受热易变质变味的物品的灭菌。4）化学消毒剂70%75%乙醇，溶解脂类，脱水作用，蛋白质变性，适用于皮肤及工具表面消毒。3%5%石碳酸，蛋白质变性，损伤细胞膜，适用于地面家具皮肤器皿。5%10%甲醛，破坏蛋白质氢键或氨基，凝固蛋白，与氨基结合破坏蛋白质氢键或氨基，适用于物品消毒，接种室熏蒸，无菌室发酵车间消毒。1%KMnO4，氧化蛋白质的活性基团，适用于皮肤啤酒发酵罐。10%20%漂白粉，破坏细胞膜、酶、蛋白质，适用于发酵车间地面设备表面发酵用水。十九、细菌、酵母菌、放线菌、红曲霉主要繁殖方式细菌繁殖方式：一般进行无性繁殖，即细胞的横分裂称作裂殖，首先核区伸长并分裂细胞赤道附近的细胞膜由外向中心作环状推进。放线菌繁殖方式：以无性方式繁殖，主要是形成孢子，也可通过菌丝断片繁殖（液体培养中），生长到一定阶段，一部分气生菌丝分化为孢子丝，孢子丝成熟形成许多孢子。酵母菌繁殖方式：1、无性繁殖：芽殖，细胞核临近的中心体产生一个小突起同时细胞表面向外突出逐渐冒出小芽然后部分已经增大和伸长的核、细胞质、细胞器等进入芽内，最后芽细胞从母细胞得到一套完整的核结构、线粒体等，与母细胞分离并成为独立的细胞。裂殖，裂殖酵母属，酵母细胞的径间出现横隔之后，就会横向裂开形成两个细胞，同时形成裂痕，然后逐渐在原细胞和新长出的细胞间留下一道环状的疤痕。芽裂繁殖，介于出芽和横隔形成两者之间的繁殖法，很少见，首先在芽基很宽的颈处出芽，然后形成一层横隔将芽与母细胞分开。2、有性繁殖：两个有亲和性的单倍体母细胞各自伸出一根管状原生质体突起，然后吻合形成一结合桥，先行质配，后进行核配，形成双倍体，一定条件下双倍体形成子囊进行减数分裂，分裂成不同数的子核，形成子囊孢子，也有未经性细胞结合而形成子囊孢子的。红曲霉繁殖方式：1、有性繁殖：产子囊孢子（书P120）2、无性繁殖：产分生孢子，在菌丝或其分枝的顶端直接产生分生孢子。二十、二次生长曲线Ecoli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，因而产生了两个对数生长期之间间隔着一个生长延滞期的二次生长现象，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成，葡萄糖耗尽后分解乳糖酶系才被诱导合成，出现延滞期，合成后能利用乳糖使菌体生长出现二次生长。二十一、青霉素和溶菌酶制备原生质体的作用机理原核生物中的细菌和放线菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，可用溶菌酶破壁，一分子肽聚糖有一个单位的N乙酰葡糖胺和N乙酰胞壁酸以1,4糖苷键连接，1,4糖苷键易被溶菌酶水解。霉菌用蜗牛酶、纤维素酶破壁，酵母菌用蜗牛酶和葡聚糖酶破壁青霉素的作用机制是抑制肽聚糖分子中肽桥的生物合成，从而抑制新生细胞壁的合成，主要作用于革兰氏阳性菌。二十二、诱变剂及诱变机理1、物理诱变剂：有非电离辐射类的紫外线、激光和离子束等，能够引起电离辐射的X射线、射线和快中子等，常用的有紫外线和射线。紫外线：由于DNA强烈吸收紫外线，尤其是它链上的碱基，嘧啶对UV的敏感性比嘌呤强很多，紫外线引起DNA结构变化形式很多，如DNA链断裂DNA分子内分子间交联，核算与蛋白质交联及嘧啶产生两类光化合物即二聚体和水合物，其中T=T的形式是DNA生物学活性改变的主要原因。相邻的嘧啶形成二聚体后造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物死亡或突变。（为避免光复活修复应在红光下操作，处理后菌悬液若需要增殖培养，也可用黑布包起来进行避光培养）X射线和射线：能引起物质电离作用，因而直接或间接改变DNA结构，直接效应是造成碱基与脱氧核糖之间的糖苷键、脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的断裂。间接地效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子引起缺失和损伤，电离辐射还能引起染色体畸变，但发生了染色体断裂的细胞常常不稳定复制时会引起分离，这是此类诱变剂的一个缺点。2、化学诱变剂：1）碱基类似物：不影响DNA复制，取代核酸分子中的正常碱基，再通过DNA复制引起突变，只对生长状态细胞起作用，对处于静止态细胞（细胞悬液、孢子悬液、芽孢悬液）没效果。例：5溴尿嘧啶（BU）、5溴脱氧尿嘧啶（BD）胸腺嘧啶（T）的结构类似物；2氨基嘌呤（AP）是腺嘌呤（A）的结构类似物。2）烷化剂：带有一个或多个活性烷基，通过烷化磷酸基、嘌呤和嘧啶而与DNA作用。例：甲基磺酸乙酸（EMS）硫酸二乙酯（DES）亚硝基胍（NTG）由于具有很高的活性，而且能与水起作用，溶液必须在使用前配制，水溶液不易出仓，水合作用后通常形成没有诱变能力的化合物并且是有毒的。3）移码诱变剂：能插入DNA分子两相邻的碱基之间，使DNA分子长度增加，并使双螺旋伸展或解开一定的长度，在DNA分子上减少