版免疫学专业实践能力培养技术指南1.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流版免疫学专业实践能力培养技术指南1.精品文档.免疫学实验课的目的和要求免疫学是动物医学科学领域中的一门重要学科。在学习免疫学的过程中，不仅需要掌握本学科的基础知识、基本理论，同样重要的是不能忽视免疫学作为实验性科学而不断发展的事实。因而，我们在教学过程中，注重对学生进行免疫学技术操作及实验能力的培养。免疫学实验课是整个免疫教学中重要的有机组成部分。一、实验课目的： 1 加深和巩固对系统理论知识的理解和体会。 2 熟悉和掌握免疫学实验的基本技能。 3 培养正确的科学态度和思维分析能力。 二、实验课要求： 1为提高实验课效果，每次实验前必须认真预习。了解实验原理、材料与方法、注意事项以及预期的实验结果。认真写实验计划。2加强基础训练，每次实验过程中应注意基本技术、基本操作、基本训练。坚持严肃性、严格性和严谨性。3示教实验和录像实验要仔细观察。 4自行操作要认真、准确。 5为提高科学思维、分析、总结能力，每次实验结束后必须认真地记录结果，进行分析，得出结论，完成实验报告。 6. 全部实验课结束后，以小组为单位，完成一份科研项目申请书的撰写任务，并按时交给老师。实验室守则 1尊重教师、友爱同学，严肃认真，严谨求实。2进入实验室应穿白大衣，保持安静，遵守秩序，不允许在实验室接听电话。3爱护仪器设备。节约试剂。尤其是贵重仪器的使用，未经指导教师许可，不得擅自动用。如遇器材损坏或其它意外情况应及时报告指导教师。4保持实验室整洁、卫生，实验完毕后应整理好器材、物品，关好水、电、门窗，废弃物应根据不同性质作适当处理，并将实验室打扫干净。桌椅放回原处。5. 严格遵守国家生物安全法和动物传染病法，不得擅自处理试验后的动物及其器官，要在专业教师的指导下进行严格消毒和无害化处理。 本科生免疫学试验计划写作格式淋巴细胞增殖 试验计划专业与班级 姓名 学号 成绩： 1. 理论依据或原理；2. 本试验的用途（举例说明，例如，诊断、治疗、疫苗评价等）；3. 目的（解决什么问题，达到什么要求）；4. 材料：必须有3种主要试剂的公司联系电话、价格、试剂规格、 多 少优惠、到货时间、保存条件等；5. 仪器设备，规格，型号等注明；6. 试验方法：写明方法名称，主要步骤等；7. 小组人员分工：小组内人员的安排；8. 注意事项，安全，卫生，记录等。注：实验计划应在实验开始前一周提交给任课教师。实验报告的书写兽医免疫学、免疫学实验报告按学校的统一格式进行书写。特别注意：每次试验结束后，要求各位同学到图书馆查找一篇学术论文，这篇论文的研究方法中应用了你刚学过的方法，并要写出短评，对其方法应用是否合理作出评价。注：实验报告应在实验结束后一周提交。实验一 凝集反应一、 目的1. 了解血清学方法的原理2. 血清学方法在微生物诊断中的作用3. 学会利用血清稀释法测定免疫血清的效价。二、 原理：颗粒性抗原(如细菌或红血球)的悬液与含有特异性抗体的血清混合，在适量电解质存在的情况下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。 参加反应的抗原称凝集原（灭活的布鲁氏菌体），其血清（布鲁氏菌阳性血清）中的抗体，称为凝集素。凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由亲水溶胶变成疏水溶胶。疏水溶胶性质不稳定，水中的电解质使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生了凝集现象。试管凝集反应（agglutination in test tubes）是用已知颗粒性抗原检测未知抗体及其相对含量的半定量试验。此法为免疫血清定量测定效价法。三、应用：凝集试验可以用于定性的检测，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性；也可以进行半定量检测，即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为血清效价。可进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应（Widal test）、布鲁氏菌病的瑞特氏反应（Wright test）均属定量凝集反应。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛应用于兽医临床检验。四、材料：（1）耗材：试管、试管架、移液器、记号笔；（2）试剂：生理盐水、布鲁氏菌悬液、阳性血清、阴性血清；（3）仪器：恒温箱；五、方法：(1) 取清洁干燥的小试管12支，排列在试管架上，（最好标记好序号，以免弄混）。(2) 用移液管加入生理盐水，第1管加入2.3 m1 ，其余2-9管加入0.5m1生理盐水。(3 )用移液管吸取待检血清0.5m1，注入第一管，并吸吹三次混匀；然后由第一管依次吸 取0.5m1注入第二管、第二管到第三管如此类推到第九管为止。（从第九管吸出0.5m1弃去）（以上九管为倍比稀释）。（4）在每管中加入0.5m1经处理的布鲁氏菌菌悬液，作为抗原。第10-12管作为对照。第10试管为抗原对照，加抗原与生理盐水。第十一管加阳性血清（0.5ml）和抗原。第十二管加阴性血清和抗原。(5)摇匀，并置37恒温箱内作用，次日再观察结果。观察结果时勿摇动试管六、观察管底是否有凝集现象。记录结果完全凝集，凝集块完全沉于管底，液体澄清，以“十十十十”记录;凝集块沉于管底，液体稍混，以“十十十”记录;部分凝集，液体混浊，以“十十”记录;极少凝集液体混浊以“十”记录。无变化记以“一”*取“十十”的稀释度作为免疫血清的效价。实验二 沉淀试验双向免疫扩散试验一、目的要求：1. 掌握双向免疫扩散试验的原理和用途；2. 熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。二、实验原理：1. 沉淀反应：可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。2. 抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。3. 血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。4. 双向免疫扩散试验：将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，若抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例合适处形成白色沉淀线。5. 抗原抗体反应的特点：1. 特异性 2. 比例性 3.可逆性6. 带现象：Ag与Ab比例不适而不出现可见反应。前带(prozone) 抗体过量时；后带(postzone)抗原过量时。7. 沉淀反应的抗原可以是多糖、类脂、蛋白质或它们的结合物等。与相应的抗体相比，抗原的分子量小，单位体积内所含抗原量多，具有较大的反应面积。因此，在作定量沉淀试验时，为了不使抗原过剩而生成不可见的可溶性复合物，通常应稀释抗原。8. 每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。9. 参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。三、实验用途：沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断（鸡马立克氏病、法氏囊病、炭疽杆菌抗原），各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定。四、材料：（1）耗材：平皿、试管、枪头；（2）试剂：琼脂粉、8.5% 高渗盐水、待检血清、法氏囊抗原；（3）仪器：高压锅、打孔器、移液器、湿盒、恒温箱。五、实验方法：1. 琼脂板的制备：1克琼脂粉溶于100ml 8.5% 高渗盐水，高压灭菌，待温度降至55oC左右时，无菌操作下倾注于平皿中，制成厚约2mm左右的琼脂板。2. 打孔：在琼脂板上打梅花孔，孔径为2mm,中间空和周围孔间的距离大约为3mm。3. 加样：将待检血清作倍比稀释，即1：2、1：4、1：8、1：16，分别加至周围孔中，中间加抗原（法氏囊抗原）。4. 作用：将琼脂板放置湿盒中，在37oC恒温箱中作用24h。5. 结果观察：抗原抗体在凝胶为扩散，在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。四、注意事项：打孔加样时，不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。孔间距要相等。实验三 实验动物接种方法一、试验目的：熟悉并掌握实验动物的疫苗接种途径与方法二、试验原理：接种疫苗的目的是激发保护性免疫应答并形成免疫记忆，从而使动物免遭感染的危害。疫苗种类：根据传统与习惯，疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、抗毒素、亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗等。接种途径的确定应根据疫苗种类、畜禽日龄及免疫目的而定，主要有以下几种途径：气雾法、注射法（肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内）、饮水法、点眼、滴鼻法、灌胃法等。一般活苗采用饮水、喷雾、滴鼻、点眼、注射免疫，灭活苗则需肌肉或皮下注射。三、实验材料：1ml注射器、生理盐水、滴管、灌胃器、每两人一只小鼠四、实验方法：注射法（肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内）、点眼、滴鼻法、灌胃法。1注射接种方法（1）皮下注射接种（多点注射法）皮下注射接种是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。注射量约为0.1-0.3ml/10g体重。（2）皮内注射接种（多点注射法）是将药液注入皮肤的表皮和真皮之间，观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应，接种、过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和食指按住皮肤使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连接4.5针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上挑起并梢刺入，将药液注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘，而皮肤上的毛孔极为明显。注射量为0.1ml/次。（3）肌肉注射接种（多点注射法）小鼠体积小，肌肉少，很少采用肌肉注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时，采用肌肉注射。操作时1人保定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1条后肢，右手拿注射器。将注射器与半腱肌呈90°角迅速插入1/4,注入药液.用药量不超过0.1ml/10g体重.(4)静脉注射接种将小鼠放在金属笼或鼠夹中,通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴,用左手抓住小鼠尾巴中部.小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉,2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面,3条静脉呈品字型分布,一般采用左右两恻的静脉.拔去沿尾部静脉走向的毛,置尾巴于45-50温水中浸泡几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭尾部,以达到消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的.行尾部静脉注射时,以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧,使静脉更为充盈,用中指从下面托起尾巴,以无名指夹住尾巴的末梢,右手持4号针头注射器,使针头与静脉平行(小于30°角),从尾巴的下1/4处进针,开始注入药物时应缓慢,仔细观察,如果无阻力,无白色皮丘出现,说明已刺入血管,可正式注入药物.有的实验需连日反复尾静脉注射接种,注射部位应尽可能从尾端开始,按次序向尾根部移动,更换血管位置注射接种。注射量为0.05-0.1ml/10g体重。拔出针头后，用拇指按住注射部位轻压1-2min，防止出血。应当注意，此途径因绕过淋巴结，故不利于细胞免疫的建立。（5）腹腔注射左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3nm左右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。注射量为0.1-0.2ml/10g体重。2. 滴鼻接种左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，对准鼻孔滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不准的要重滴。3. 点眼接种法左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，对准眼睛滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能松手，吸入不准的要重滴。4. 灌胃法小鼠专用灌胃针由注射器和喂管组成，喂管长约1nm，喂管尖端焊有一金属小圆球，金属球中空，用途是防止喂管插入时造成损伤。金属球弯成20度角，以适应口腔与食道之间弯曲。将喂管插头紧紧连接在注射器的接口上，吸入定量的药液；左手捉住小鼠，右手拿起准备好的注射器。将喂管针头尖端放进小鼠口腔，压迫鼠头部，使口腔与食管成一直线。轻轻转动针头以刺激鼠的吞咽，将针头顺咽后壁轻轻插入食管下段，如遇阻力，可轻轻上下滑动，不能强行插入。一旦感觉阻力突然消失有落空感时，轻抽注射器，如无气泡抽出，则表明针头已进入胃。如此时动物安静，呼吸无异常，可将药液注入。若动物出现剧烈挣扎，进针阻力很大或动物呼吸困难，则可能是插入气管内，此时必须立即退出重插。操作时动作轻柔以防损伤食管及膈肌。一般灌胃针头插入长度小鼠为2.5cm-3.5 cm。用中指与拇指捏住针筒，食指按着针竿的头慢慢往下压，即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。五、注意事项1. 注意安全，避免被动物咬伤。2. 注射器要避免重复使用，注射部位的消毒要彻底。实验四 免疫血清（多克隆抗体）的制备一、 目的要求： 加深对抗体基本知识的了解。 掌握多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 熟练运用检测抗体效价的方法。二、 原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分抗原决定簇相结合。将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和再次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和再次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。三、 应用在临床上，多克隆抗体可用于紧急治疗。在实验室，多克隆抗体可用于蛋白质的分离与鉴定，还可用于病原体的蛋白质组学诊断。四、 材料 实验动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和绵羊制备。 免疫用的动物应选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。本实验用成年健康远交系公兔。 实验器材家兔保定台；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药匙；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 实验试剂 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分成分 完全佐剂 不完全佐剂 石蜡油 6 份 + + 无水羊毛脂 4 份 + +杀死的分枝杆菌 3-5 mg + -磷酸缓冲溶液 10 份 + +（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）4. 乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。少量时，特别是福氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。当大量乳化时，可采用胶体磨进行。 五、 实验方法 抗原的制备抗原制备的主要目的在于使被免疫动物能够产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、凝胶电泳等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为清晰可见的单一条带，将该条带连同周围的凝胶一块切下，用适当缓冲液浸泡，使该多肽从凝胶中解离出来（此步称为洗脱），即可制得纯化的抗原。 对于从临床病例中分离到的病原体，在国家法律许可的前提下，可直接与完全弗氏佐剂按一定比例混合，制成疫苗类似物。用此免疫动物也可获得高效价的多克隆抗体。 预放血轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 注射抗原 准备两只成年兔，将100µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 收集血液 将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。 将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药匙将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。六、 结果若用颗粒性抗原免疫动物，则用试管凝集法检测抗体效价。若用可溶性抗原免疫动物，则用琼脂扩散试验检测抗体效价。七、 注意事项1. 乳化一定要彻底（乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。）2. 根据抗原的性质和动物的免疫应答状态来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。 3. 细菌和异种动物细胞可直接用于免疫动物。4. 再次注射（即强化免疫）时应减慢注射速度，以免动物出现超敏反应而死亡。5. 在制备抗原、免疫动物和收集血液等过程中，必须严格无菌操作。八、自助实验（是由学生自己组织并自行实施的必做实验）通过上述方法所制备的免疫血清只有在鉴定与纯化后才能用于免疫学实验，其目的是为了确定免疫血清中特异性抗体的含量，即抗体效价。常用微量滴定板法进行抗体效价的检测。实验动物为小鼠，其它试剂与材料参见溶血空斑实验。实验五 免疫细胞分离与计数一、 实验目的1. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的技术与细胞计数法。2. 掌握脾细胞的分离与计数方法。二、 实验原理外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）包括淋巴细胞和单核细胞，其中T细胞约占50-70%，B细胞约占10-15%，单核细胞约占10-25%，还有部分NK细胞和其他细胞。常规的促分裂原诱导的T细胞增殖试验和特异性抗原诱导的T细胞增殖试验可直接用PMBC作为靶细胞，其中混杂的单核细胞可作为抗原递呈细胞促进细胞增殖。对于要求较高纯度T细胞的试验，可以从PMBC中再纯化T细胞。因此，分离和获取外周血单个核细胞（PMBC）是检测T细胞免疫功能的基础。目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法直接分离PMBC。用来分离人和动物外周血PMBC的分离液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）泛影酸葡甲胺（Urografin）(F/H)分离液。当将抗凝血叠加在淋巴细胞分离液表面水平离心后，由于红细胞、粒细胞、单个核细胞、血浆等的比重不同，会出现分层现象，即在离心管中出现5层：最上层是血浆（内含血小板），血浆层和淋巴细胞分离液层之间是PMBC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黄层。吸取血浆与淋巴细胞分离液层之间的白色细胞，即为所需的PMBC。三、 试剂与材料1. 比重为1.077±0.001kg/L的淋巴细胞分离液；2. 无菌Hanks液（4。C冰箱保存，临用时将PH值调至7.37.6）；3. 1%台盼蓝染液；4. 柠檬酸钠抗凝剂；5. 含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液；6. 其它：无菌注射器、碘酒、酒精、无菌试管、无菌吸管、无菌枪头、血球计数板、微量移液器、显微镜、计数器、水平离心机等。四、 操作步骤1. 在一15mL无菌离心管中加入适量的柠檬酸钠溶液，采集鸡静脉血，迅速轻柔混匀;2. 取1mL抗凝血与等体积的无菌Hanks液混匀;3. 再取一无菌试管，加入1mL淋巴细胞分离液;4. 然后将2mL稀释的血液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上;5. 将试管置于水平离心机中，2000rpm，离心20min；6. 用毛细吸管轻轻插到上层（血浆层）与中间层（分层液）之间的乳白色浑浊的PMBC层，吸取PMBC，然后移入另一试管中；7. 加入5倍体积以上的Hanks液，轻轻混匀，1500rpm，离心15min，吸弃上清液。重复洗涤细胞2次；8. 末次离心后，弃上清，加入1mL含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液，重悬细胞；9. 取一滴细胞悬液与一滴1%台盼蓝染液混匀，于血球计数板上，计数4个大方格内的细胞总数；PMBC细胞浓度（细胞数/mL细胞悬液）=（4个大方格内细胞总数/4）×104×2(稀释倍数)10. 细胞活力检测：死细胞可被染成蓝色、体积略膨大，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率，正常情况下，活细胞百分率应在95%以上人 活细胞百分率%=（活细胞数/总细胞数）×100%五、 注意事项1. 采血时应注意无菌操作，试验中所用材料、试剂均应无菌；2. 将稀释的血液叠加于分层液上时，应细心，动作轻柔，避免冲散分层液与分层液混合，进而影响分离效果；3. 吸取PMBC时，应避免吸出过多上清液分层液而导致血小板污染；4. 试验中所用的溶液均要求等渗，具有缓冲作用，并对细胞无毒性；5. 配置好的细胞可置于0-4。C暂时保存；6. 整个操作过程应尽可能在短时间内完成，减少死细胞数。六、自助实验（是由学生自己组织并自行实施的必做实验）小鼠脾细胞的分离与计数：现将小鼠实施安乐死，并对其体表进行彻底消毒，在左侧季肋部将腹壁切开，暴露脾脏，切断脾系膜，迅速将脾放入盛有RPMI 1640培养基的平皿中，将脾脏的两端各剪断2 mm，用注射器抽吸平皿中的培养基，再将针头刺入脾脏的实质内，轻推注射器活塞，使培养基进入脾脏内，于是在高压下，脾内的淋巴细胞被冲出，反复几次，直至脾脏的颜色显著变浅。收集平皿中的培养基，按上述方法进行淋巴细胞计数。实验动物为小鼠，其它试剂与材料同上。实验六 免疫细胞的活力测定一、 实验目的：掌握常用的细胞活性测定方法。二、 实验原理：在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞样本中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。本实验应用台盼蓝染色技术测定免疫细胞的活力，因为正常健康的细胞具有完整的细胞膜而能够排斥台盼蓝，不着色；而台盼蓝却能扩散到细胞膜完整性丧失而死亡的细胞中，使其着色。借助细胞对染料台盼蓝的排斥作用可以测定细胞群体中活细胞的数目。三、 实验材料和试剂：1、细胞总数已知的细胞悬液2、1%台盼蓝染液3、其它：无菌试管、无菌吸管、无菌枪头、血球计数板、微量移液器、显微镜、计数器等。四、 实验方法：1、取0.5ml已计数的细胞悬液加入无菌试管中。2、加入1%台盼蓝染液0.5ml ，染色23min。3、吸取一滴染色后悬液涂于血球计数板上。4、于显微镜下计数4个大方格内的死细胞数（着染为蓝色）。5、计数出的死细胞数，按下式计算出细胞存活率。 细胞存活率=（细胞总数-死亡数）/细胞总数×100%五、备注： 1、死细胞能被台盼蓝染色，镜下可见深蓝色膨胀细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 2、计数时要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。实验七 淋巴细胞增殖试验一、 目的要求：1. 掌握淋巴增殖试验的原理与用途；2. 熟悉淋巴细胞增殖试验常用的技术方法。二、实验原理：1.淋巴细胞增殖试验又称淋巴细胞转化试验（Lymphocyte proliferation / transformation test）,是指淋巴细胞在体外培养时，受到特异性抗原或非特异性促有丝分裂原（如植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A (ConA)）刺激后，可出现细胞内蛋白质及核酸合成增加，细胞体积增大，胞质增加，出现空泡，核仁明显，染色质疏松，并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞增殖或淋巴细胞转化，其增殖能力或转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平。 淋巴细胞增殖试验常用的方法有形态学方法、3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR)掺入法，MTT比色以及荧光染料流式细胞仪计数法等，可根据不同的试验条件及试验目的，选择不同的试验方法。2.本试验目的是形态学方法，观察小鼠血液中的T淋巴细胞在体外培养过程中，当加入促有丝分裂原ConA(刀豆蛋白A)刺激后，可转化为体积较大的淋巴母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁，把细胞制成涂片，在显微镜下可观察到细胞转化的典型形态。为什么只考虑T淋巴细胞而不考虑B淋巴细胞？因为： 促有丝分裂原 小鼠T细胞 小鼠B细胞 ConA / PHA + -也就是说，ConA / PHA能刺激T细胞增殖，而不能刺激B细胞，而其他细胞如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡成碎片。三、应用：该实验是细胞免疫学功能检测的一项基本技术，即可在临床上作为测定机体细胞免疫功能的指标之一，也可用于免疫药理学的研究，T细胞功能检测（新药开发，疫苗研制）。四、实验材料1. 动物：清洁级小鼠20只/班；2. 试剂：肝素抗凝剂，RPMI-1640完全细胞培养基，NH4cl (8.5g/L),甲醇，吉姆萨-瑞士染液，ConA；3. 耗材：无菌青霉素小瓶，离心管，吸管，载玻片；4. 仪器：离心机，水浴锅，CO2培养箱，显微镜。五、试验方法：1. 先向无菌的1.5ml离心管中加入肝素抗凝剂50l；2. 取清洁级小鼠，75%酒精消毒（吸水纸吸干），在无菌操作台中用酒精棉球将小鼠眼球周围消毒，无菌条件下摘取眼球采血，滴入盛有抗凝剂的离心管中； 采血方法3. 取无菌肝素抗凝血0.3ml加入盛有2.7ml RPMI-1640培养液的无菌青霉素小瓶中，同时加入刀豆蛋白（ConA）(5g/ml)0.05ml,对照组不加ConA; 或ConA2g/ml加入1×107淋巴细胞。4. 将细胞置37,5%CO2培养箱中培养3天，每天摇动1次；5. 培养结束后，将培养物摇匀并移入1.5ml离心管中，1500r/min×10min；6. 弃上清，用4ml氯化铵液在室温下溶解红血球，约10min, 1700r/min×10min，弃上清；7. 取沉淀细胞推片，火焰固定，滴数滴瑞氏-吉姆萨染液入玻片盖满标本，4min，再加入2-3滴PBS倍染1-3 min，倾去染液，蒸馏水洗，上油镜观察。六、油镜观察结果：转化的淋巴细胞体积增大，直径约20-30m，形态不整齐，常有小突起，核变大，有核仁1-2个，胞浆增多，常出现胞浆空泡。未转化的淋巴细胞直径一般为6-8m，核染色致密，一般无核仁。油镜下计数200个淋巴细胞，按下式计算转化率。淋巴细胞转化率=（转化的淋巴细胞数÷200）×100%七、注意事项：实验中须严格无菌操作，防止污染。实验八 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）一、目的要求1. 熟悉酶联免疫吸附试验的原理及用途；2. 掌握生物素-亲和素系统ELISA法的原理和操作方法。二、原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。生物素-亲和素系统ELISA（BA-ELISA）法是结合生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的高度放大作用，建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可以和生物素分子亲密结合；生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。首先将抗原（或抗体）结合到聚苯乙烯微量反映板孔中并保持其免疫活性；然后加入待检标本（测定其中的抗体或抗原），使其与聚苯乙烯微量反映板孔中的抗原或抗体起反应；再加入生物素和辣根过氧化物酶标记的亲和素。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特技性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。三、应用：ELISA法可以检测体液中微量的特异性抗体或抗原，故广泛用于动物传染病的诊断、兽医药理学试验、食品卫生检验和各种细胞蛋白质的定量检测。四、材料：1. 试剂：动物干扰素(IFN-)ELISA试剂盒 1个/班；2. 仪器：酶标仪，移液器；3. 耗材：枪头，酶标板。五、操作步骤（用于检测未知抗原的BA-ELISA）：1.包被抗体：（1）配制包被缓冲液：取出包被缓冲液原液，用去离子水将其10倍稀释（0.4ml:3.6ml）；（2）稀释抗体（Capture Ab）:用包被缓冲液稀释抗体（4l:4ml）；（3）在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加100l，用封板膜封板，放入湿盒中4过夜（18-24h）；2. 洗板：次日，弃取孔内溶液，用洗涤缓冲液（每孔200l）洗1次，每次2min；3. 封闭：（1）配液（Assay diluent）:用去离子水5倍稀释Assay diluent:5×Assay diluent: 去离子水=1:4=4ml:16ml（2）每孔加200l，室温孵育10min；4. 洗板：同2；5. 加样：（1）配标准样：分别配成2000pg/ml,1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.25 pg/ml,15.625 pg/ml;（2）在第一竖排的孔中加入100l/well配好的标准样，用于制作标准曲线；（3）加待测样：加入待测样品100l/well（未知抗原）于反应孔中，同时作空白孔。用封板膜封板，放入湿盒中37孵育10min,洗板；6. 加生物素：（1）稀释Detection Ab: Detection Ab: Assay Diluent=1l:1ml=4l:4ml（2）加于每孔100l，用封板膜封板，放入湿盒中37孵育10min,洗板；7. 加A-HRP:（1）稀释Avidin-HRP(辣根过氧化物酶标记的亲和素)： Avidin-HRP：Assay Diluent=16l:4ml（2）加于每孔100l，用封板膜封板，放入湿盒中37孵育10min,洗板；8. 底物显色：于上述各反应孔中加入TMB底物应用液（Substrate）100l，室温孵育10min;9. 终止反应：加2M H2SO4 50l/well以终止反应；10. 结果测定：450nm酶标仪提前30min预热，读出OD值，分析数据。六、注意事项；1. 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不要溅出，不可产生气泡。每次加标本应更换枪头，以免发生交叉污染。2. 在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，为把非特异性吸附的干扰物质洗涤下来，充分的洗涤和浸泡是必要的。实验九 腹腔巨噬细胞收集与吞噬试验一、目的要求1. 掌握分离小鼠腹腔巨噬细胞的操作方法；2. 掌握巨噬细胞吞噬功能测定的原理；3. 掌握巨噬细胞吞噬功能测定的操作方法。二、实验原理巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成细胞，同时又是一类主要的抗原提呈细胞，在特异性免疫应答的诱导与调节中起着关键的作用：巨噬细胞能有效的吞噬和清除病原微生物；巨噬细胞能够有效的加工和处理抗原，启动适应性免疫应答；巨噬细胞能够介导并促进炎症反应；巨噬细胞对肿瘤和病毒感染细胞具有强大的杀伤功能。因此，巨噬细胞的分离和检测对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。小鼠是分离巨噬细胞最常用的材料来源。由于直接收集小鼠腹腔巨噬细胞的