生物化学实验.doc

【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流生物化学实验.精品文档.实验一、甲醛滴定法测定氨基氮一、 实验目的：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、 实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：对溶液氨基酸含量的测定主要依据平衡中电离H+的浓度来确定。因此，反应平衡应向右进行。平衡向右的促进方式：1）增加底物的浓度A、增加AA的浓度（本实验目的是测定氨基酸的含量，必须保证固定的氨基酸浓度；B、加碱，让H+电离。但NH3+ 是弱酸，完全解离时pH为1112或更高，若用碱滴定NH3+所释放的H+ 不测量氨基酸，一般指示剂色域小于10，很难准确指示终点。因此，直接用碱滴定是不可行的。 2）降低产物的浓度在本实验中用加入过量甲醛的方式：常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使平衡右移，促使NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，同时也使滴定终点从强碱区域（pH1112）移至弱碱区域（pH9.0左右）。而这一区域正好是酚酞的敏感变色区域(pH810)。因此，可用酚酞用指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定（刚好微红）。二羟甲基氨基酸羟甲基氨基酸NaOH中和由滴定所用的NaOH量就可计算出溶液中氨基酸的含量，这就称氨基酸的甲醛滴定法。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。当然，如样品是蛋白质水解液，（实际上是多种氨基酸的混合物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但是，基本规律如下：当蛋白质水解时，放出游离的氨基，随着水解程度的增加，滴定值也增加。当滴定值不再增加，表示水解作用已完全。相反，蛋白质合成时游离氨基减少。因此，可以用此法测定溶液中的氨基量，就能大体判断出蛋白质水解或合成的进度。三、 实验器材1、25ml锥形瓶 2、微量滴定管 3、吸管 4、移液管四、 实验试剂1、0.1mol/L标准甘氨酸溶液 300ml准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。2、0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液 500ml3、酚酞指示剂 20ml0.5%酚酞的50%乙醇溶液4、 中性醛溶液 400ml在50ml 36%37% 分析纯甲醛溶液中加入 1mL 0.1% 酚酞乙醇水溶液，用 0.1mol/L的NaOH溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。 五、 实验操作1、 取3个25ml的锥形瓶，编号。向第2、3号瓶内各加入 2ml 0.1mol/L的标准甘氨酸溶液和 5mL 水，混匀。向1号瓶内加入 7mL水。然后向3个瓶中各加入 5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混们，分别用0.1mol/L标准氢氧化钠滴定至溶液显微红色。重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。 编号试剂1(Control)2(Standard Gly)3 (Standard Gly)4(Sample)5(Sample)甘氨酸（mL）00.1mol/L Gly 2ml0.1mol/L Gly 2ml未知浓度 2ml未知浓度 2mlH2O (ml)75555酚酞（滴）55555甲醛（ml）222220.1mol/L NaOH计算氨基氮2、 取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做两份（4、5号），取平均值。计算每mL甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。六、 实验结果1、氨基氮的回收率公式中实际测得量为滴定（2、3号）瓶消耗用的标准氢氧化钠溶液mL数的平均值与第1号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液mL数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008。即为加入理论量的mg数。 2、氨基氮的含量 式中：为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。为滴定对照液（2、3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。mol/LNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实摩尔浓度。实验二、蛋白质的性质实验（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应一、 实验目的：1、 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2、 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。二、 实验原理（呈色反应）蛋白质分子结构中某种化学键或氨基酸残基中的某些化学基团能与特定的化学试剂产生特定的有色物质，称为蛋白质的呈色反应。各种蛋白质分子中氨基酸残基不完全相同，因此产生的颜色也不完全一样。当然呈色反应并不一定是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质也能产生类似折颜色。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果来判断被测物质是否为蛋白质。 （一）双缩脲反应（Birut reaction） 1、原理尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子有肽键。其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。硫酸铜加热注意：双缩脲反应不仅含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个CSNH2， CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH，或CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺（O=C（NH2）C（NH2）=O等物质有此反应。 NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。2、 试剂1）尿素 10g 3）2%硫酸铜溶液 60mL2)10%氢氧化钠溶液 250mL 5）0.5 %Glu溶液4）2%卵清蛋白溶液 (1:6) 80mL 鸡蛋清用蒸馏水稀释6倍，通过23层纱布滤去不溶物即得。3、 操作取少量尿素结晶（火柴头大小），放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨基酸，形成双缩脲。冷却备用，为1号。再取两支：分别加入卵清蛋白溶液和Glu溶液，为2号和3号。编 号123双缩脲（少许）卵清蛋白（1ml）Glu(1ml)10% NaOH （滴）5552% CuSO4 (滴)111现 象在上述三支试管中分别进行如下操作：加10%氢氧化钠溶液约1mL（5滴），振荡混匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。摇匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，随加随振荡。观察紫玫瑰色的出现。（二）茚三酮反应 1、原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合基本分子和氨缩合生成有色物质。反应机理如下： 此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过在时甚至不显色。 2、试剂 1）蛋白质溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：6）2）0.3% Glu溶液 80mL 3）0.1% 茚三酮水溶液 50mL3、操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加23滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉红色变紫红色再变蓝。1（卵清蛋白）2（Glu）3 (Tyr)体积（ml）111茚三酮（滴）333 （三） 黄色反应1、 原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2、 试剂1）鸡蛋清溶液 100mL 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。2）头发 3）指甲4）0.3%色氨酸溶液 10mL 5）0.3% 酪氨酸溶液 10mL6）0.5%苯酚溶液 50mL 7）浓硝酸 200mL 8）40%氢氧化钠溶液 100mL3、 操作向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置，或用微火加热。等各管出现黄色后，于室温下逐滴加入40%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号123456材 料（滴）0.5%苯酚4鸡蛋清4指 甲少 许头 发少 许0.5%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）4281081044显色时间加氢氧化钠现 象实验三 蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应注：实验前将水浴锅的水加热。一、 目的1） 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2） 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3） 了解蛋白质变性与沉淀的关系。二、 原理蛋白质在水溶液中是稳定的胶体溶液：1）蛋白质颗粒表面有很多极性基团，与水有很高的亲和性。水易在蛋白质颗粒外形成一层水化膜，使蛋白质颗粒相互分开，避免相互碰撞形成大颗粒而沉淀；2）蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，不致聚集而沉淀。因此，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成稳定的亲水胶体颗粒。在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类：1）可逆的沉淀反应 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。（等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等）2）不可逆沉淀反应 在强烈条件下，破坏蛋白质的水化层或电荷。此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。引起不可逆沉淀的因素：加热、重金属盐、生物碱（如苦味酸、钨酸、鞣酸）以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)、强酸或强碱等。 蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。因此变性蛋白质并一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质（如可逆性沉淀）也未必都已变性。三、 试剂与材料1、蛋白质溶液 （1） （2） （3）5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）2、3%硝酸银溶液 10mL （2）3、5%硫酸铜溶液 10mL （2）4、饱和硫酸铵溶液 250mL （1）5、硫酸铵结晶粉末 1000g （1）6、0.1mol/L 盐酸溶液 300mL7、0.01% 氢氧化钠溶液 100mL （2）8、0.05mol/L 碳酸钠溶液 100mL9、 10% 醋酸溶液 100mL （2） （3）10、1% 醋酸溶液 20mL （3）11、饱和NaCl溶液 （3）12、10% 氢氧化钠溶液 （3）四、 操作（一）蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。5%卵清蛋白（5mL）+5mL饱和硫酸铵 混匀后静置数分钟 过滤 （改用吸管吸出上清液） 沉淀（即为球蛋白） 上清液 （改用吸管吸出上清液） 加少量水 加入硫酸铵粉末 观察现象 过滤 上清液（弃去） 沉淀（即为清蛋白） 加少量水 观察现象如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。（二）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。原理：当溶液的pH>蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电，此时的蛋白质一旦遇到重金属盐类（如：Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等）就易形成不溶性盐而沉淀。重金属盐类与蛋白质发生的沉淀反应通常较为完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。（在实践中，如误服重金属盐的病人可口服大量牛奶或豆浆等，缓解中毒，其原因是牛奶是高蛋白食品。蛋白质与重金属离子形成的不溶性盐可以通过服用催吐剂排出体外）。但要注意：在使用重金属盐（如CuSO4、PbAc2）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。取一支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生，放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解，为什么？管号试剂1234蛋白质样液(mL)22220.01% NaOH (ml)-1-10% HAc (mL)1-11金属离子(滴)5% CuSO411-3% AgNO3-11现 象加H2O是否溶解酸性碱性酸性碱性（三）加热沉淀蛋白质1、 原理几乎所有的蛋白质都因加热变性而沉淀或凝固。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因是由于高温破坏了蛋白质的水化层，使蛋白质天然结构解体，疏水基团外露。A、蛋白质的热变性作用与加热时间和温度有关。加热的温度越高，时间越长，沉淀越彻底。B、蛋白质的热变性与溶液pH有关。在强酸或强碱溶液中，蛋白质分子带正电或负电荷，即使加热也不会发生沉淀；当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。这是因为，一方面，加热破坏了水化层，另一方面，蛋白质处于等电点时也破坏了它的带电状态。C、少量盐类可以促进蛋白质的加热凝固。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含CaSO4）的制豆腐; 即使在强酸或强碱状态，加入一定的中性盐后就可使蛋白质加热而凝固。管号试剂12345蛋白质样液(mL)1111110% HAc (滴)55000H2O (滴)0050010% NaOH (滴) 00050饱和NaCl (滴)05005现 象沉淀溶于水的现象实验四、蛋白质的性质实验（三） 蛋白质的等电点测定一、 实验目的：1、 了解蛋白质的两性解离性质。2、 学习测定蛋白质等电点的一种方法。二、 实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：其分子中所含的自由氨基和羧基均可能解离。当溶液的pH值大于蛋白质的等电点，氨基的解离胺到抑制而羧基的解离度增大，此时蛋白质分子为带负电荷的阴离子。反之，当溶液的pH小于蛋白质等电点时，羧基的解离受到抑制而氨基的解离增加，而使蛋白质分子带正电荷。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH即为酪蛋白的等电点。三、 实验器材水浴钠、温度计、200ml锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵四、 实验试剂1、0.5%酪蛋白醋酸钠溶液 200mL取纯酪蛋白（干酪素）0.05 g加蒸馏水20mL及1mol/LNaOH溶液5mL，混合使之溶解，再加1mol/L HAc溶液5mL，定容至50mL即可。2、1.00mol/L醋酸溶液 100mL3、0.10mol/L醋酸溶液 100mL4、0.01mol/L醋酸溶液 50mL五、 实验操作1） 取同样规格的试管5支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 试 剂编 号蒸馏水（mL）0.01mol/L 醋酸(mL)0.1mol/L 醋酸(mL)1.0mol/L 醋酸(mL)pH14.190.315.924.370.135.334.00.54.742.52.04.153.70.83.5pI2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4、5管的pH依次为5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。 观察其混浊度，静置10分钟，再观察其混浊度。最混浊的一管即为酪蛋白的等电点。实验五 酪蛋白的制备一、 目的学习从牛乳是制备酪蛋白的原理和方法。二、 原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。三、 器材1、离心机 2、抽滤装置3、精密pH试纸或酸度计 3、电炉5、烧杯 6、温度计四、 试剂与材料1、牛奶 2500mL2、95%乙醇 1200mL3、无水乙醚 1200mL4、0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 3000mL先配制A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAc.3H2O 54.44g,定容至2000mL。B液：0.2mol/L醋酸溶液 称优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000mL。5、 乙醇-乙醚混合液 2000mL 乙醇-乙醚=1：1（V/V）五、 操作1、 将100mL 牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲溶液100mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至 4.7。将上述悬浮液冷却至室外温。离心15min (3000r/min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、用水洗沉淀3次，离心10min (3000r/min)，弃去上清液。3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合物液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。4、 将沉淀摊开在表面皿上，风干；得得酪蛋白纯品。5、 准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白 g/100mL牛乳 (g%)式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。思考题制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？常见的溶剂按极性大小顺序依次排列水>甲酸>甘油>二甲基亚砜>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙醛>醋酸>乙酸乙酯>蓖麻油>乙醚>氯仿>植物油>四氯化碳>液体石蜡。实验六 蛋白质含量测定和纯度鉴定-双缩脲法一、 目的1、 掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。2、 学习使用721型分光光度计。二、 实验原理尿素在180C 条件下脱氨生成双缩脲：在碱性溶液中双缩脲与Cu2+作用形成稳定的紫红色络合物，称为双缩脲反应。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键。凡是具有两个或两个以上的酰胺基，或通过甲叉相连的寡肽、多肽及蛋白质等，都有双缩脲反应。当Cu2+与蛋白质作用时，存在着严格的定量关系，即一个Cu2+与四个肽键的N原子络合，络合物溶液颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用比色法测定蛋白质的含量。A=KCL三、 实验材料1、 双缩脲试剂： CuSO4·5H2O 1.5g，酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g，加500ml蒸馏水溶解之，边搅拌边加300ml 10% NaOH(10% NaOH配法：将65%-75%的NaOH溶液放置一定时间，使混入的碳酸钠沉淀，取其透明的上清液稀释之)用水定容至1000ml，用聚苯乙烯瓶贮存。此试剂可长期保存，为了增加试剂的贮藏性，可加入0.1%的碘化钾，此时兼有防止析出铜的还原作用。2、 蛋白质标准溶液：配制酪蛋白（10mg/ml）溶液。四、 操作：1、 制作标准曲线：按下表加入试剂：试剂123456标准酪蛋白溶液（ml）00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.61.20.80.40双缩脲（ml）333333OD540蛋白质浓度（mg/ml）00.81.62.43.24上述各管试剂混匀后，室内温静止2030min 后于540nm处比色，以第一管作为空白对照管。以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标，作蛋白质与OD的标准曲线图。2、 知浓度酪蛋白样品测定：取未知浓度样品1ml，加水补至2ml，再加4ml双缩脲试剂，混匀后，静止2030min,于540nm处比色。根据蛋白质与OD标准曲线图，计算样品中酪蛋白的含量。3、 蛋白纯度鉴定：纯度（%）=样品中酪蛋白实测量（mg）/添加酪蛋白量（mg）×100%五、 结果与讨论 物理法：射率法、比浊法、放射性同位素法 利用共性 凯氏法蛋白质定量法 双缩脲法：比色法Lowry法 利用特定氨基酸残基 紫外法 比色法 色素结合法蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农副产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。蛋白质定量的意义是：测定或算出一定数量或容量的样品中所含蛋白质成分的数量。 现有的多种蛋白质定量法，都是根据蛋白质分子的理化性质进行的。这些方法大体可分为利用蛋白质药共性（含氮量、肽键、折射率等）和利用蛋白质含有特定氨基酸残基（芳香族、酸性、碱性等）两类。实验七 紫外吸收法测定蛋白质的含量一、 目的要求1、 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理和操作。2、 了解紫外分光光度计的原理及使用方法。二、 原理由于蛋白质分子结构中具有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和和酪氨酸）残基，因此，对280nm的紫外光有最大吸收，而且280nm的吸收值与蛋白质溶液的浓度成正比，可用于蛋白质的定量测定。三、 材料（一）试剂1、 标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的蛋白质（酪蛋白或牛血清白蛋白），用蒸馏水精确稀释成1mg/ml的浓度。2、 样品液：浓度为1mg/ml左右的酪蛋白溶液（配制2mg/ml）。（二）器材1、紫外分光光度计；试管；吸管四、 实验方法1、 标准曲线的绘制取五支试管编号，按下表加下各试剂：管号12345标准蛋白质溶液（ml）蒸馏水（ml）蛋白质浓度（mg/ml）04.001.03.00.252.02.00.53.01.00.754.001.0试剂加完后混匀，在紫外分光光度计上于280nm处测定其OD值，作OD值-蛋白质浓度曲线。2、 样品测定取待测蛋白质样品1.0ml，加蒸馏水3.0ml在波长280nm处测OD值，从标准曲线上查其浓度。五、 结果讨论1、 紫外吸收法可测定0.10.5mg/ml的蛋白质溶液，该法迅速、简单，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280nm进行紫外检测来判断蛋白质吸附或洗脱情况最常用的方法。2、 对于测定那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。3、 核酸在280nm处也有吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm处的吸收值，通过计算就可以消除其对蛋白质测定的影响，不过因不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过计算校正，测定结果还存在着一定的误差。实验八 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、 实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、 实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液的pH<pI，带正电荷; pH>pI时，带负电荷。在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同，通过电泳就可以将分子大小不同的蛋白质分开。 电泳方法主要：1）自由界面电泳（将蛋白质溶于缓冲液中通过进行电泳）；2）区带电泳（将蛋白质溶液点在浸含有缓冲液的支持物上进行的电泳）。区带电泳又可根据支持物的性质进行分类：纸电泳、薄膜电泳（醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜）、凝胶电泳（琼脂糖凝胶分离核酸、聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质和寡核苷酸等）、粉末电泳（淀粉、纤维素粉或硅胶粉等）、细丝电泳（尼龙丝和其他人造丝电泳）。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由醋酸纤维素制成（醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化而得，将其溶于有机溶剂如丙酮、氯仿、氯乙烯、醋酸乙酯等后，涂抹成均一薄膜，即为醋酸纤维素薄膜），它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120µm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。血清中含有数种不同的蛋白质，血清中含有多种蛋白质：有四种球蛋白即1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白；一种清蛋白。由于它们的分子量各异，所带电荷不等，因而在电场中移动速度各不相同，可以利用醋酸纤维薄膜作为支持物进行电泳将它们分开。血清各蛋白质的分子量：血清组分清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白分子量（MW）690002000003000009万15万15.6万pI4.645.065.065.126.357.30电泳所用的缓冲溶液是巴比妥缓冲液（pH8.6），因此各种蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动。三、 器材1、醋酸纤维薄膜（2×8cm） 2、常压电泳仪3、点样器 4、培养皿（染色及漂洗用）5、粗滤纸 6、玻璃板7、竹镊 7、白磁反应板四、 试剂1、巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07） 1000mL巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000mL。2、染色液 300mL含氨基黑 10B 0.5g, 甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL（可重复作用）。3、漂洗液 2000mL含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL4、透明液 300mL含无水乙醇7份，冰醋酸3份。五、 操作1、 浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号）放在巴比妥缓冲液中浸泡20分钟。2、 点样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端23cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3、 电泳 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧巾在支架上，即为滤纸桥（它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”）。粗糙面朝下，膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。1） 稳流15min：0.3mA/cm,每一膜条的电流为2×0.3=0.6mA；总电流为：膜条数×0.6mA；2） 稳压25min：电压至160V，电流强度0.40.6mA/cm膜宽。待电泳区带展开2535mm后关闭电源。 4、 染色 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10min.5、 漂洗 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。思考题1、 用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点？2、 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？3、 绘图：蛋白质在薄膜上的位置与形状。实验九 凯氏定氮法测定蛋白质的含量一、实验目的掌握凯氏定氮法的基本原理和操作二、实验原理凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提