03－蛋白质(5-7)1110.ppt

第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的沉淀反应三、蛋白质的沉淀反应四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性五、蛋白质的颜色反应五、蛋白质的颜色反应一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质+OH+H+OH+H+COOHPrH3N+COOPrH3N+COOPrH2NpH pI pH = pI pH pI 由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。 一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白值时，蛋白质解离成正离子和负离子的趋势相等，质解离成正离子和负离子的趋势相等，为兼性离子，即总净电荷为零，此时在为兼性离子，即总净电荷为零，此时在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这个也不向阴极移动，这个pH值称为值称为蛋白质蛋白质的等电点的等电点，用，用pI来表示。来表示。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质分散相质点小于分散相质点小于1 nm时称为真溶液，分时称为真溶液，分散相质点大于散相质点大于100 nm时称为悬浊液，而分时称为悬浊液，而分散相质点在散相质点在1100 nm之间时称为胶体溶液。之间时称为胶体溶液。蛋白质在水溶液中的颗粒约为蛋白质在水溶液中的颗粒约为1100 nm，所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相分散相，水是，水是分散介质。分散介质。蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜等性质。应以及不能透过半透膜等性质。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质利用蛋白质不能透过半透膜的性质，常利用蛋白质不能透过半透膜的性质，常将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中，置于流水中逐渐将小分子杂质除去，袋中，置于流水中逐渐将小分子杂质除去，起到纯化的目的，这种方法即为起到纯化的目的，这种方法即为透析。透析。利用蛋白质不能透过半透膜的性质发展利用蛋白质不能透过半透膜的性质发展了的另一蛋白质纯化方法了的另一蛋白质纯化方法超滤。超滤。二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质形成水化层形成水化层形成双电层形成双电层为什么蛋白质具为什么蛋白质具有胶体性质有胶体性质三、蛋白质的沉淀反应三、蛋白质的沉淀反应1盐析和盐溶法盐析和盐溶法2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法3重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法4生物碱试剂以及某些酸类生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质沉淀蛋白质5加热凝固加热凝固1盐析和盐溶法盐析和盐溶法等电点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；加入少量盐等电点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；加入少量盐离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐溶：盐溶：少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。原理：原理：蛋白质吸附某种盐离子蛋白质吸附某种盐离子双电层双电层蛋白蛋白质彼此排斥。质彼此排斥。 蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。而溶解度提高。1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐析盐析蛋白质分子表面聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分蛋白质分子表面聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。1盐析和盐溶法盐析和盐溶法盐析：盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀。解度，从而使蛋白质沉淀。常用：常用：以硫酸铵（中性盐）最常应用。因以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。淀。如酒精的消毒作用。在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。3重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。电，易与金属离子结合成盐。通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。变性的蛋白质。4生物碱试剂以及某些酸生物碱试剂以及某些酸 类沉淀蛋白质类沉淀蛋白质某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。沉淀条件应当是沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。5加热凝固加热凝固将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。可使蛋白质发生凝固而沉下。鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。变成固体样的东西了。四、蛋白质的变性和复性四、蛋白质的变性和复性1蛋白质变性的概念蛋白质变性的概念2蛋白质变性的诱因与结果蛋白质变性的诱因与结果3蛋白质变性的机理蛋白质变性的机理4蛋白质的复性蛋白质的复性1蛋白质变性的概念蛋白质变性的概念蛋白质变性是指通过某些物理或化学蛋白质变性是指通过某些物理或化学因素的作用，使蛋白质天然的因素的作用，使蛋白质天然的空间构象空间构象破坏破坏，从而引起蛋白质若干理化和生物，从而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。学性质的改变。蛋白质变性作用的蛋白质变性作用的实质是维持蛋白质实质是维持蛋白质分子高级结构的次级键和二硫键被破坏分子高级结构的次级键和二硫键被破坏，引起天然构象解体，但维持主链的共价引起天然构象解体，但维持主链的共价键肽键并未被打断，即一级结构保持键肽键并未被打断，即一级结构保持完好。完好。1蛋白质变性的概念蛋白质变性的概念2蛋白质变性的诱因与结果蛋白质变性的诱因与结果能使蛋白质变性的因素很多，可分能使蛋白质变性的因素很多，可分为化学因素和物理因素两大类。为化学因素和物理因素两大类。化学因素有强酸、强碱、尿素、胍、化学因素有强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇等。酸、苦味酸、浓乙醇等。物理因素有加热（物理因素有加热（70100）、）、剧烈振荡或搅拌、紫外线及剧烈振荡或搅拌、紫外线及X射线照射线照射、超声波等。射、超声波等。 2蛋白质变性的诱因与结果蛋白质变性的诱因与结果蛋白质变性后，常常会有如下表现蛋白质变性后，常常会有如下表现:生物学活性丧失生物学活性丧失;某些侧链基团暴露出来某些侧链基团暴露出来;生物化学性质的改变生物化学性质的改变;一些理化性质改变一些理化性质改变;3蛋白质的复性蛋白质的复性复性复性:某些变性蛋白质，再除去变性因素某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以后，可以“复性复性” 。蛋白质的复性是一个十分复杂的过程，除了要去蛋白质的复性是一个十分复杂的过程，除了要去除变性因素，多数蛋白还需要一些除变性因素，多数蛋白还需要一些其他因素的协其他因素的协助助来恢复蛋白质的正确折叠。在复性过程中，不来恢复蛋白质的正确折叠。在复性过程中，不同的蛋白质充分体现出自身的特性，同的蛋白质充分体现出自身的特性，没有可以通没有可以通用的方法用的方法。 五、蛋白质的颜色反应五、蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应是指利用蛋白质的结构蛋白质的颜色反应是指利用蛋白质的结构或利用肽键、以及酚基等特殊氨基酸残基或利用肽键、以及酚基等特殊氨基酸残基的特性，使其与一些试剂发生反应而生成的特性，使其与一些试剂发生反应而生成有色物质。有色物质。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸的一些颜色蛋白质由氨基酸组成，氨基酸的一些颜色反应蛋白质往往也都具有。反应蛋白质往往也都具有。氨基酸所没有的一些颜色反应，主要是氨基酸所没有的一些颜色反应，主要是双双缩脲反应缩脲反应，是蛋白质常用的定量分析方法。，是蛋白质常用的定量分析方法。五、蛋白质的颜色反应五、蛋白质的颜色反应原理原理:蛋白质分子中含有许多和蛋白质分子中含有许多和双缩脲双缩脲结构结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。红紫色混合物。应用应用:可以用此反应来定性测定蛋白质；也可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在可在540nm处比色，定量测定蛋白质。处比色，定量测定蛋白质。五、蛋白质的颜色反应五、蛋白质的颜色反应2H2NC NH2H2NCNCNH2NH31320COOHO尿素尿素双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质紫红色物质第五节第五节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质氨基酸氨基酸性质性质蛋白质蛋白质性质性质两性两性性质性质物理物理性质性质两性两性性质性质紫外紫外吸收吸收化学化学性质性质分离纯分离纯化测定化测定盐析盐析等电点等电点凝胶凝胶过滤过滤分子分子大小大小胶体胶体性质性质沉淀沉淀作用作用NH2COOH共同共同R基基颜色颜色反应反应含量含量测定测定变性变性复性复性离子离子交换交换电泳电泳含量含量测定测定第六节第六节 氨基酸及蛋白质的分析和分离氨基酸及蛋白质的分析和分离一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化三、蛋白质的定量检测三、蛋白质的定量检测四、蛋白质的纯度分析四、蛋白质的纯度分析一、氨基酸的分析分离一、氨基酸的分析分离1层析法的基本原理层析法的基本原理2常用的氨基酸层析方法常用的氨基酸层析方法类型：类型：分配层析法分配层析法( (包括柱层析、纸层析包括柱层析、纸层析和薄层层析和薄层层析) )。基本原理：基本原理：所有的层析系统通常都为两所有的层析系统通常都为两个相组成。一个为固定相的或静相；一个个相组成。一个为固定相的或静相；一个为流动相或动相。为流动相或动相。1层析法的基本原理层析法的基本原理 利用层析法分离混合物，例如氨基酸利用层析法分离混合物，例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异分配系数要有差异，哪怕是很小的差异，哪怕是很小的差异，一般差异越大，越容易分开。一般差异越大，越容易分开。 1层析法的基本原理层析法的基本原理2常用的氨基酸层析方法常用的氨基酸层析方法（1）纸层析）纸层析（2）薄层层析）薄层层析（3）离子交换层析）离子交换层析（4）高效（高压）液相色谱）高效（高压）液相色谱（1）纸层析）纸层析纸层析是利用混合物各组分在流动相和固定纸层析是利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中分配系数的差异，将它们相两种不同溶剂中分配系数的差异，将它们分离开。分离开。纸层析以滤纸为隋性支持物，滤纸纤维和水纸层析以滤纸为隋性支持物，滤纸纤维和水有较强的亲和力，在一般条件下较难脱去，有较强的亲和力，在一般条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以纸层析的纸层析的固定相是被滤纸纤维吸附的结合水固定相是被滤纸纤维吸附的结合水。纸层析以纸层析以有机溶剂为流动相有机溶剂为流动相，也称为层析液，也称为层析液，在毛细拉力的作用下，层析液能不断由下向在毛细拉力的作用下，层析液能不断由下向上流动。上流动。（1）纸层析）纸层析层析时，混合氨基酸在水和有机相之间层析时，混合氨基酸在水和有机相之间不断进行分配，使它们分布在滤纸的不同不断进行分配，使它们分布在滤纸的不同位置，从而使物质得到分离和提纯。位置，从而使物质得到分离和提纯。最后用茚三酮显色。最后用茚三酮显色。（1）纸层析）纸层析氨基酸的混合物点在氨基酸的混合物点在滤纸的一个角上，把滤纸的一个角上，把这个点称为原点。这个点称为原点。氨基酸在滤纸上移动氨基酸在滤纸上移动的速度称为比移值或的速度称为比移值或迁移率，以符号迁移率，以符号Rf代代表。表。Rf也就是原点到也就是原点到层析斑点（即原色点）层析斑点（即原色点）中心的距离中心的距离(DA)与原与原点到溶剂前沿的距离点到溶剂前沿的距离（Ds）的比值。）的比值。RfDA/ DS （2）薄层层析）薄层层析薄层层析的基本原理是利用混合物各组薄层层析的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附性能、溶解性能分在某一物质中的吸附性能、溶解性能（即分配）或者其它亲和作用性能的差异，（即分配）或者其它亲和作用性能的差异，使混合物溶液中的各种物质，进行反复的使混合物溶液中的各种物质，进行反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。开。根据分离的原理不同，薄层层析可以分根据分离的原理不同，薄层层析可以分为为吸附薄层层析和分配薄层层析吸附薄层层析和分配薄层层析两类。两类。（2）薄层层析）薄层层析（3）离子交换层析）离子交换层析离子交换层析是一种用离子交换剂作为支离子交换层析是一种用离子交换剂作为支持剂的层析方法。持剂的层析方法。分离原理是在一定离子强度和分离原理是在一定离子强度和pH等条件等条件下，由于样品中目标纯化分子和杂质分子下，由于样品中目标纯化分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附与解吸能力不同，达与吸附剂之间的吸附与解吸能力不同，达到分离纯化目标分子的目的。到分离纯化目标分子的目的。一般需经过加样、吸附、洗涤、洗脱和凝一般需经过加样、吸附、洗涤、洗脱和凝胶再生几个环节。胶再生几个环节。 （3）离子交换层析）离子交换层析（3）离子交换层析）离子交换层析常用于氨基酸分离的离子交换剂是树脂。常用于氨基酸分离的离子交换剂是树脂。带有正电荷的树脂称之为阴离子交换树脂。带有正电荷的树脂称之为阴离子交换树脂。而带有负电荷的称之为阳离子树脂。它而带有负电荷的称之为阳离子树脂。它们分别和不同带电性质的离子基团发生离们分别和不同带电性质的离子基团发生离子交换。子交换。 （ 4）高效（高压）液相色谱）高效（高压）液相色谱液相色谱法是以液体为载体，将样品带入液相色谱法是以液体为载体，将样品带入色谱仪进行分析的方法。色谱仪进行分析的方法。高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）采用了高压泵、高）采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器等，使分离效能、效分离柱、高灵敏度检测器等，使分离效能、分析速度、检测灵敏度比经典液相色谱有了分析速度、检测灵敏度比经典液相色谱有了很大的提高。很大的提高。HPLC适用于分析分离不易挥发的极性物质。适用于分析分离不易挥发的极性物质。（ 4）高效（高压）液相色谱）高效（高压）液相色谱高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成。部分组成。 （ 4）高效（高压）液相色谱）高效（高压）液相色谱氨基酸的高效液相色谱图氨基酸的高效液相色谱图 二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化 1蛋白质分离纯化的一般步骤蛋白质分离纯化的一般步骤 2蛋白质分离纯化的常用方法蛋白质分离纯化的常用方法 1蛋白质分离纯化的一般步骤蛋白质分离纯化的一般步骤（1）材料的预处理及细胞破碎）材料的预处理及细胞破碎（2）蛋白质的抽提）蛋白质的抽提（3）蛋白质粗制品的获得）蛋白质粗制品的获得（4）样品的进一步分离纯化）样品的进一步分离纯化（1）材料的预处理及细胞破碎）材料的预处理及细胞破碎预处理的主要目的是去除原材料中的部分预处理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性杂质，分离含有蛋白的细胞。可溶性杂质，分离含有蛋白的细胞。分离提纯某一种蛋白质时，首先要采用适分离提纯某一种蛋白质时，首先要采用适当的方法将组织和细胞破碎。当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎方法有：机械破碎法、渗透破常用的破碎方法有：机械破碎法、渗透破碎法、反复冻融法（对温度变化敏感的蛋白碎法、反复冻融法（对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法）、超声波法和酶法等。机质不宜采用此法）、超声波法和酶法等。机械破碎法是最常用的细胞破碎方法械破碎法是最常用的细胞破碎方法 。（1）材料的预处理及细胞破碎）材料的预处理及细胞破碎选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来，首先获得蛋白质粗制品。蛋白分离开来，首先获得蛋白质粗制品。方便有效的方法是根据蛋白质溶解度的差方便有效的方法是根据蛋白质溶解度的差异进行分离。异进行分离。常用下列几种方法：等电点沉淀法、盐析常用下列几种方法：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法。法、有机溶剂沉淀法。 （2）蛋白质的抽提）蛋白质的抽提选择适当的缓冲液把蛋白质提取出来，即选择适当的缓冲液把蛋白质提取出来，即为蛋白质的抽提。为蛋白质的抽提。抽提所用缓冲液的抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备蛋白质的性质分等条件的选择应根据欲制备蛋白质的性质而定。而定。在抽提过程中，应注意选择合适的温度条在抽提过程中，应注意选择合适的温度条件，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。件，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （3）蛋白质粗制品的获得）蛋白质粗制品的获得常用的方法有：层析法（凝胶过滤层析、常用的方法有：层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等）；电泳法和超离子交换层析、亲和层析等）；电泳法和超离心法等。离心法等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品较高纯度的蛋白质样品 。2蛋白质分离纯化的常用方法蛋白质分离纯化的常用方法（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法（2）利用溶解度差别的纯化方法）利用溶解度差别的纯化方法（3）根据电荷不同的纯化方法）根据电荷不同的纯化方法（4）利用选择性吸附的纯化方法）利用选择性吸附的纯化方法（5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法）利用对配体的特异亲和力的纯化方法（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法透析法透析法超滤法超滤法 离心法离心法凝胶过滤法凝胶过滤法 （1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法血液透析血液透析小分子溶出小分子被小分子被带出带出透析机透析机透析液透析液血液血液加加压压透析透析透析法是利用蛋白透析法是利用蛋白质的分子比较大，不质的分子比较大，不能透过半透膜的特点，能透过半透膜的特点，实现蛋白质与小分子实现蛋白质与小分子物质分离的方法。物质分离的方法。（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法超滤超滤利用一定的压力使利用一定的压力使样品通过半透膜，这样品通过半透膜，这时，小分子和水组成时，小分子和水组成的溶质可以被滤过，的溶质可以被滤过，而大分子的蛋白质则而大分子的蛋白质则留在膜内，这种方法留在膜内，这种方法称为超滤法，亦称微称为超滤法，亦称微滤法。滤法。（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法离心分离是利用离心惯性力的作用分离非均离心分离是利用离心惯性力的作用分离非均相混合物的方法。相混合物的方法。由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于颗由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于颗粒本身的性质，而且也取决于悬浮颗粒介质粒本身的性质，而且也取决于悬浮颗粒介质以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度梯以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度梯度离心法对蛋白质进行分离。度离心法对蛋白质进行分离。密度梯度离心法是在离心管中通过某种介质密度梯度离心法是在离心管中通过某种介质来提供一个密度梯度环境，然后加入待分离来提供一个密度梯度环境，然后加入待分离的物质，通过离心的方法达到分离的目的。的物质，通过离心的方法达到分离的目的。离心法离心法蔗糖浓度蔗糖浓度48121620塑料离心管塑料离心管滴加样品滴加样品蛋白质蛋白质的位置决的位置决定于它的定于它的大小，密大小，密度。度。（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法离心法离心法（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以对含有不同大小分子的混合物进行分离。对含有不同大小分子的混合物进行分离。凝胶过滤层析是通过一定的载体来实现凝胶过滤层析是通过一定的载体来实现的，载体的孔径不同，分离的分子大小范的，载体的孔径不同，分离的分子大小范围也不相同。围也不相同。分离过程是基于蛋白质在自由流动溶剂分离过程是基于蛋白质在自由流动溶剂和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。凝胶过滤法凝胶过滤法 （3）根据电荷不同的纯化方法）根据电荷不同的纯化方法A A 装好的凝胶过滤层析柱；装好的凝胶过滤层析柱； B B 蛋白质混合物上样；蛋白质混合物上样； C C 不同大小的蛋白质分子通不同大小的蛋白质分子通过层析柱；过层析柱； D D 蛋白出峰图；蛋白出峰图；凝胶过滤法凝胶过滤法 利用凝胶过滤层析，除了可以利用凝胶过滤层析，除了可以进行混合物的分离外，还能测进行混合物的分离外，还能测定样品的相对分子质量。定样品的相对分子质量。 （2）利用溶解度差别的纯化方法）利用溶解度差别的纯化方法溶液的溶液的pH会影响蛋白质的溶解度。会影响蛋白质的溶解度。 溶液中的盐离子浓度也会影响蛋溶液中的盐离子浓度也会影响蛋白质的溶解度。白质的溶解度。溶剂的极性同样会影响蛋白质的溶剂的极性同样会影响蛋白质的溶解度。溶解度。（2）利用溶解度差别的纯化方法）利用溶解度差别的纯化方法当溶液的当溶液的pH与蛋白质的等电点相同时，与蛋白质的等电点相同时，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方法称为法称为等电点沉淀。等电点沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用这不同蛋白质具有不同的等电点，利用这一特性，可以通过改变溶液的一特性，可以通过改变溶液的pH，使要，使要分离的蛋白质沉降出来，这些蛋白质仍分离的蛋白质沉降出来，这些蛋白质仍然能够保持天然的生物学活性，该方法然能够保持天然的生物学活性，该方法可以应用于蛋白质的粗分离。可以应用于蛋白质的粗分离。（2）利用溶解度差别的纯化方法）利用溶解度差别的纯化方法盐溶现象。盐溶现象。盐析现象。盐析现象。（2）利用溶解度差别的纯化方法）利用溶解度差别的纯化方法与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水。间的作用力，使蛋白质脱水。有机溶剂的加入能降低溶液的介电常数，有机溶剂的加入能降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间的作用力增强，蛋白质分使蛋白质分子间的作用力增强，蛋白质分子易于聚集沉淀。子易于聚集沉淀。 （3）根据电荷不同的纯化方法）根据电荷不同的纯化方法电泳电泳离子交换层析离子交换层析电泳电泳电泳是溶液中带电粒子（离子）在电场中移电泳是溶液中带电粒子（离子）在电场中移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度不同而使目标分子分离的技术称为电泳技术。不同而使目标分子分离的技术称为电泳技术。在一定的在一定的pH溶液中，蛋白质的迁移方向取溶液中，蛋白质的迁移方向取决于它们带电的性质和数量，同时也受蛋白决于它们带电的性质和数量，同时也受蛋白质形状的影响。质形状的影响。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以完全依据蛋白质的相对）可以完全依据蛋白质的相对分子质量，来对蛋白质进行分离。分子质量，来对蛋白质进行分离。蛋白质电泳通常使用的支持物是聚丙烯酰胺蛋白质电泳通常使用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶。凝胶。 电泳电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳示意图电泳示意图 电泳电泳等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性稳定的线性pH梯度中进行电泳。梯度中进行电泳。不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电泳结束后，会分别聚集于其等电点的位置，泳结束后，会分别聚集于其等电点的位置，这样不同的蛋白质分子就得以分离。这样不同的蛋白质分子就得以分离。离子交换层析离子交换层析 是用离子交换树脂作支持剂的一种是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。高分子化合物。离子交换层析离子交换层析RCHCOOHNH3+M1A+RCHCOOHNH3M1+A+ 氨基酸氨基酸（在酸性溶液中）（在酸性溶液中）阳离子阳离子交换剂交换剂 氨基酸盐氨基酸盐RCHCOONH2+M2B RCHCOO M2NH2+ B 氨基酸氨基酸（在碱性溶液中）（在碱性溶液中）阴离子阴离子交换剂交换剂 氨基酸盐氨基酸盐M1为酸性基团，为酸性基团，M2为碱性基团为碱性基团（4）利用选择性吸附的纯化方法）利用选择性吸附的纯化方法吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同，达吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同，达到使它们分离的目的。到使它们分离的目的。硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，能够将其它分子吸附在表面。能够将其它分子吸附在表面。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和蛋白质的性质三个因素。和蛋白质的性质三个因素。 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法）利用对配体的特异亲和力的纯化方法原理：原理：利用蛋白质分子能与其相对应利用蛋白质分子能与其相对应的配体进行特异的、非共价的、可逆的的配体进行特异的、非共价的、可逆的结合来分离纯化，即结合来分离纯化，即亲和层析法亲和层析法。配体：配体：指能与某些蛋白质进行特异结指能与某些蛋白质进行特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。等。（5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法）利用对配体的特异亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒三、蛋白质的定量检测三、蛋白质的定量检测1凯氏定氮法凯氏定氮法2紫外紫外-分光光度计法分光光度计法3双缩脲法（双缩脲法（Biuret法）法）4Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）5考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法染色法（Bradford法）法）6BCA法法1凯氏定氮法凯氏定氮法原理：原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占占16%），因此测出样品中氮的含量后，即），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。可求得样品中蛋白质含量。每克样品中含氮的克数每克样品中含氮的克数6.25100=100克克样品中蛋白质的含量（克样品中蛋白质的含量（克%）。）。2紫外紫外-分光光度计法分光光度计法由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在左右具有最大吸收，所以在280nm吸收吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定蛋白质浓度蛋白质浓度mg/ml=1.45A2800.74 A260由于此法非常简便，条件要求低，因此常作由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用为粗略定量蛋白质的方法来使用 。3双缩脲法（双缩脲法（Biuret法）法）包含肽键基团的化合物能与硫酸铜包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧氢氧化钠溶液产生化钠溶液产生双缩脲颜色反应双缩脲颜色反应，生成紫红，生成紫红色或蓝紫色的复合物。色或蓝紫色的复合物。在在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。质的含量在一定范围内呈线性关系。双缩脲法的测定范围为双缩脲法的测定范围为110 mg蛋白质。蛋白质。优点是快速，缺点是灵敏度差。优点是快速，缺点是灵敏度差。4Folin-酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法）又叫又叫Lowry法法其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在比，在650660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。质含量。此法比双缩脲法灵敏此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在倍。蛋白质测量范围在25250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还因此是通用的方法之一。但其受还原剂、原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。质的种类不同，有较大的变动。5考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250染色法染色法（Bradford法）法）用考马思亮兰用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有强烈吸收峰。的光波下，有强烈吸收峰。常用此反应来定量测定蛋白质含量。常用此反应来定量测定蛋白质含量。6BCA法法BCA法是对一价铜离子敏感、稳定和高法是对一价铜离子敏感、稳定和高特异性活性的试剂。特异性活性的试剂。在碱性溶液中，蛋白质将二价铜离子还在碱性溶液中，蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子，一价铜离子与测定试剂原成一价铜离子，一价铜离子与测定试剂中的中的BCA形成一个在形成一个在562 nm处具有最大光处具有最大光吸收的紫色复合物，该复合物的光吸收强吸收的紫色复合物，该复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。度与蛋白质浓度呈正比。因此，可用因此，可用BCA法来测定蛋白质含量。法来测定蛋白质含量。四、蛋白质的纯度分析四、蛋白质的纯度分析1溶解度分析溶解度分析2电泳法电泳法3超离心沉降法超离心沉降法4免疫学方法免疫学方法5分光光度法分光光度法6化学分析法化学分析法1溶解度分析溶解度分析单一蛋白质的溶解单一蛋白质的溶解度曲线不因加入过量度曲线不因加入过量的试样而改变。的试样而改变。如果蛋白质制品是如果蛋白质制品是纯的，直线的斜率为纯的，直线的斜率为1，在折点以后，斜，在折点以后，斜率为零。率为零。不纯蛋白质的溶解不纯蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个度曲线常常呈现两个或两个以上的折点。或两个以上的折点。溶解的蛋白质溶解的蛋白质量量加入的固体蛋白质的量加入的固体蛋白质的量2电泳法电泳法“电泳法电泳法”只是一个相对的概念，因为在不只是一个相对的概念，因为在不同支持物上，电泳分离的效果不一样。同支持物上，电泳分离的效果不一样。在纸上电泳为一条区带的样本，在聚丙烯酰在纸上电泳为一条区带的样本，在聚丙烯酰胺凝胶泳时，可能分成数条区带；如结合等胺凝胶泳时，可能分成数条区带；如结合等电聚集电泳则更可提高分辩力，很容易检出电聚集电泳则更可提高分辩力，很容易检出微量杂蛋白质的混存。微量杂蛋白质的混存。3超离心沉降法超离心沉降法均一分子量的蛋白质其沉淀速度是一致均一分子量的蛋白质其沉淀速度是一致的，因此离心后在溶剂中形成一条明显的的，因此离心后在溶剂中形成一条明显的分界线。分界线。若为两种分子量不同的蛋白质混合时，若为两种分子量不同的蛋白质混合时，则形成二条分界线。则形成二条分界线。4免疫学方法免疫学方法蛋白质往往具有抗原性，用琼脂免疫扩蛋白质往往具有抗原性，用琼脂免疫扩散或免疫电泳法，蛋白质（抗原）与抗血散或免疫电泳法，蛋白质（抗原）与抗血清（抗体）之间可产生沉淀线。清（抗体）之间可产生沉淀线。5分光光度法分光光度法蛋白质的最大吸收峰在蛋白质的最大吸收峰在280mm，核酸在核酸在260mm，若两者比值为若两者比值为1.75以上，表示为以上，表示为纯蛋白质（纯蛋白质（OD280/ OD 260=1.8）。）。是用来检测蛋白质制品中有无核酸混存是用来检测蛋白质制品中有无核酸混存的方法。的方法。6化学分析法化学分析法应用化学分析方法测定纯化了的蛋白质试应用化学分析方法测定纯化了的蛋白质试样中的某种成分的比值，从而可以判断蛋白样中的某种成分的比值，从而可以判断蛋白质的纯度。质的纯度。免疫化学法是鉴定蛋白质纯度的有效方法免疫化学法是鉴定蛋白质纯度的有效方法，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。