抑制剂对胃癌细胞增殖的影响-精品文档.docx

抑制剂对胃癌细胞增殖的影响【摘要】目的讨论和信号通路在胃癌细胞中能否存在穿插作用。方法采用体外化学合成的特异性针对的和丝裂原激活蛋白激酶细胞外信号调节激酶信号通路的抑制剂，分别单独和联合处理体外培养的胃癌细胞，以转染阴性对照细胞作为对照组，并设不给予任何转染的空白对照组。免疫印迹法检测磷酸化和蛋白的表达水平。比色法检测癌细胞增殖抑制率。结果能降低蛋白的表达水平，并抑制癌细胞增殖±，而的表达水平则较对照组增加。能降低的表达水平，并抑制癌细胞的增殖±，水平则无明显变化，联合应用和能明显降低和蛋白的表达水平，与或单独应用比拟，显著抑制癌细胞增殖率，差异有统计学意义±，。结论特异性抑制信号通路，且抑制通路可进一步加强抑制通路的抗肿瘤增殖效果，提示和条信号通路在胃癌细胞中存在穿插作用。【关键词】；抑制剂；信号通路；穿插作用胃癌在我国乃至世界范围内均为常见的恶性肿瘤之一，其发病率与病死率在我国有上升趋势。目前，我国胃癌的整体诊治水平仍不高，针对肿瘤细胞生长、凋亡等分子生物靶点提出的分子靶向治疗逐步成为胃癌综合治疗的重点和热门。有研究表明，信号通路的活性紊乱与多种肿瘤如胃癌的构成有关，阻滞信号通路将有望成为肿瘤治疗的新策略。基因通过编码跨膜受体而诱发多级生物级联反响，进而介入如细胞增殖、凋亡、周期转变、分化、血管生成、细胞侵袭、细胞迁移、上皮细胞间充质转化等细胞生物学经过。丝裂原激活蛋白激酶细胞外信号调节激酶在多种癌细胞中呈高表达，的活化位于超家族信号转导经过中的下游，主要负责由始动的生物信息转导，处于这一通路的中心环节。有研究发现和通路存在互相作用，共同介入细胞分子生物学行为。本实验通过单独或联合阻滞这个信号通路，讨论其在胃癌细胞系中的作用及影响。报道如下。材料与方法一般材料细胞：胃癌细胞系由台州学院肿瘤研究所细胞培养实验室传代保存。试剂：培养基购自美国生物技术公司；抗体、磷酸化抗体、抗体、抗体及相关二抗试剂盒均购自美国的公司；四甲基偶氮唑盐、和二甲基亚砜购自美国的公司；及阴性对照购自美国的公司；提取总蛋白试剂盒及所需的其他试剂来源于碧云天生物技术有限公司。方法细胞培养和转染胃癌细胞置入含小牛血清的培养液中。浓度、培养。×细胞接种于细胞培养板使用孔板，其他实验采用孔板。根据讲明书建议，将浓度稀释为，应用脂质体转染法转染。转染实验分为组，干涉组、阴性对照组、空白对照组。比色法检测细胞增殖采用含胎小牛血清的培养液将贴壁细胞配成单个细胞悬液，浓度为，每孔体积细胞接种到孔板，细胞贴壁后即加处理因素，每种处理设个复孔。使用酶联免疫检测仪测定处的吸光度值，根据公式计算细胞增殖抑制率处理组平均值空白组平均值×，并绘制直方图，实验重复次。免疫印迹法检测收集各组细胞，提取总蛋白，将样品置于不连续聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，初始电压为，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，电压提高至，继续电泳直至分离胶底部。电转移至硝酸纤维素膜，封闭，与抗体、抗体或磷酸化的抗体孵育，过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇摆，显色，放射自显影。显影信号的强弱用密度分析值反映、磷酸化的、水平以蛋白为内参对照。统计学处理采用统计软件进行数据分析，计量资料组间比拟使用配对检验，多组间比拟应用方差分析，计数资料采用等级相关检验，为差异有统计学意义。结果胃癌细胞的阻滞导致活化使用脂质体转染法将载体霎时转染人胃癌细胞，转染后验证干扰细胞中活化的蛋白表达，活化的表达显著下调，即出现通路阻滞，并伴随磷酸化的表达增加，致使活化，提示活化与下调有关。见图。联合应用和对和的表达水平的影响转染能显著降低蛋白的表达水平，而的表达水平则较对照组增加；通路的抑制剂能降低的表达水平，水平则无明显变化；和联合应用后，和蛋白的表达水平均降低。见图。和联合应用对细胞增殖的影响和均能抑制胃癌细胞增殖，其细胞增殖抑制率分别为±和±，且和联合应用癌细胞的增殖率降低更明显，其细胞增殖抑制率为±，显著高于和单独处理，差异有统计学意义。见图。讨论通路家族包括个受体、和种配体，样受体、，。细胞受体与邻近细胞配体结合后，通路即被激活。激活的蛋白在金属蛋白酶肿瘤坏死因子转化酶和分泌酶复合物的蛋白水解下，释放其细胞内部分，当进入细胞核后活化复合物，则进一步调控多个下游靶基因的表达。假如采用特异性针对的下调表达则能阻断上述经过。通路在多种癌细胞中呈高表达，的活化位于超家族信号转导经过中的下游，主要负责由始动的生物信息转导，处于这一通路的中心环节。使用特异性抑制剂降低其下游磷酸化的水平，进而阻断的磷酸化活化及其下游信号级联反响，进而阻断通路的生物学效应。本组的前期工作发现，非选择性通路阻滞剂一种分泌酶抑制剂未能诱导胃癌细胞明显凋亡，却激活通路。当然，对通路家族均可能有阻滞作用，详细是哪个通路家族成员的阻滞而导致活化，以及活化对该通路阻滞的抗肿瘤作用的影响及机制尚不清楚。由于维持癌细胞生存的信号转导经过是由一个复杂的网络系统完成，对癌细胞某单一生存信号通路的阻滞常导致其他的生存信号通路的激活，进而使癌细胞有可能逃脱针对单一通路的治疗作用。本研究结果表明，能抑制癌细胞的增殖，降低蛋白的表达水平，而也能增加的表达水平。能降低的表达水平，并抑制癌细胞的增殖，但对表达水平则无明显变化。与单独使用或比拟，联合使用和阻滞这种信号通路后，能更显著地降低和蛋白的表达水及胃癌细胞的增殖率。提示信号通路被抑制后通路活性被某种程度地上调，在此基础上应用通路抑制剂，进而抑制通路，使得条通路均被抑制，则胃癌细胞的增殖抑制率更明显。由此本组设想，通路的阻滞可能会导致胃癌细胞中其他生存信号通路如通路的活化，进而使胃癌细胞有可能逃脱针对通路的靶向治疗作用。然而，该作用在不同分化程度的胃癌细胞中能否具有普遍性，以及阻滞诱导的活化对胃癌细胞恶性生物学行为的详细作用及其机制，则有待于通过本项目的深化研究。