家蚕吡哆醛激酶基因的转录表达.docx

家蚕吡哆醛激酶基因的转录表达【目的】通过对中华蜜蜂Apisceranacerana嗅觉受体AcerOrco的表达及蛋白定位分析，说明AcerOrco的表达特性，以期为进一步探索其功能提供理论根据。【方法】分别通过qT-PC技术和Westernblot技术对中华蜜蜂气味受体AcerOrcomNA及蛋白在内勤蜂和采集蜂5个组织部位(触角、头、胸、腹和足)中的相对表达量进行分析，采用免疫组化技术对AcerOrco蛋白的表达进行定位分析。【结果】定量结果显示，AcerOrco转录本在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，其中触角中的表达量最高;该基因在采集蜂各组织中的表达量普遍高于内勤蜂。AcerOrco受体蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中也均有表达，在触角和头部的表达量明显高于其他组织。定位结果显示，在内勤蜂触角中，AcerOrco主要在毛形感器中表达，板形感器中表达不明显;在采集蜂触角的板形感器和毛形感器中均有表达，但毛形感器中的表达更多一些。【结论】获得了AcerOrcomNA及其蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中的表达特性，并将这一蛋白表达定位于工蜂触角的毛形感器和板形感器中。关键词:中华蜜蜂;嗅觉受体;mNA表达;蛋白表达;蛋白定位昆虫依靠灵敏的嗅觉系统对外界环境中的气味分子进行识别，产生有利于其生存和繁衍的各种行为习性，以适应多变的环境。昆虫的嗅觉识别经过有多种蛋白介入其中，主要包括气味结合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)、化学感受蛋白(chemosensoryproteins，CSPs)和嗅觉受体(olfactoryreceptors，Ors)等(Pelosietal，2006)。其中，Ors在这一经过中发挥着重要的作用。当外界环境中的气味分子经昆虫嗅觉感觉毛表皮上的微孔进入到感器淋巴液中，与OBPs结合构成复合体。复合体穿过感器淋巴液，与神经元树突膜上的Ors相结合，启动信号转导经过，进而将化学信号转变为电信号传入大脑中枢神经系统(ützlerandZwiebel，2005)。昆虫嗅觉受体具有7次跨膜构造，与脊椎动物G蛋白偶联受体类似。但昆虫嗅觉受体的N端位于细胞膜内而C端在细胞膜外(Bentonetal，2006;Lundinetal，2007)，这与G蛋白偶联受体相反。因而昆虫的嗅觉信号转导经过并不是传统的G蛋白形式，而是一种独特的离子门控传递方式(Satoetal，2008;Wicheretal，2008)。昆虫的嗅觉受体分为两类，一类是传统的嗅觉受体，此类嗅觉受体在不同昆虫间的同源性比拟低，能够识别气味分子和信息素;另一类受体在不同昆虫间高度保守，此类受体并无感受气味的功能，但在大多数嗅觉神经元中与传统嗅觉受体共表达，被称作嗅觉共受体(olfactoryreceptorco-receptor，Orco)。Orco虽无识别气味分子的功能，但在昆虫的嗅觉识别经过中仍发挥着重要的作用。研究表明，Orco能够提高气味分子与受体的结合效率(Wetzeletal，2001;Sakuraietal，2004;Neuhausetal，2005;Nakagawaetal，2005)，还可使传统嗅觉受体在神经元树突上准确定位(Neuhausetal，2005)。作为一种典型的社会性昆虫，蜜蜂有序维持整个蜂群的生活、繁衍以及外出采集等活动都是通过嗅觉识别气味来传递的。蜜蜂还是一种重要的经济昆虫，对蜜蜂嗅觉的研究能够为制定合理的蜜蜂饲养管理方法，以及更有效地利用蜜蜂为作物传粉提供一定的理论基础。obertson和Wanner(2006)在西方蜜蜂Apismellifera全基因组测序完成的基础上，利用生物信息学方法，从中鉴定出170个Or基因，其中包含7个假基因。蜜蜂庞大的嗅觉基因家族，使它拥有超越其他昆虫更灵敏的嗅觉。中华蜜蜂Apisceranacerana是我国的本土蜂种，较西方蜜蜂嗅觉更灵敏，擅长利用零星蜜粉源(杨冠煌，2001)。因而中蜂是探究昆虫嗅觉机制良好的实验材料。张林雅等(2012)利用T-PC技术对中华蜜蜂AcerOrco基因进行了克隆，使用eal-timePC技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱;利用免疫荧光定位技术对该气味受体在中华蜜蜂工蜂触角中进行亚细胞定位，揣测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。本课题组前期采用ACE技术获得了AcerOrco的cDNA全长序列，采用荧光定量PC及原位杂交技术，对AcerOrco转录本在工蜂及雄蜂不同发育阶段的表达特点进行了研究，结果显示AcerOrco在雄蜂和工蜂不同发育阶段均有表达，工蜂中的表达量均在羽化出房前后到达最高，而雄蜂中的表达量在整个发育阶段是逐步增高的。利用原位杂交技术对AcerOrco在工蜂及雄蜂触角上的表达进行定位分析，结果显示AcerOr2的阳性杂交信号出如今触角的毛形感器和板形感器神经元细胞中(Zhaoetal，2013;赵慧婷等，2015)。本研究是在课题组前期已获得Orco基因cDNA全序列并对其mNA的时空表达特性进行分析的基础上，利用qT-PC和Westernblot技术对Orco基因在中蜂内勤蜂和采集蜂不同组织的表达情况进行了定量分析，利用免疫组织化学技术对Orco基因在中蜂触角的表达进行了定位，旨在对Orco受体的蛋白表达进行研究，并对该受体NA水安然平静蛋白水平的表达情况进行关联分析，验证其表达能否一致，以期为进一步研究该基因的功能提供理论根据。1材料与方法11试虫实验用中华蜜蜂样本均取自山西农业大学动物科技学院中蜂实验场。在蜂群中参加一张新巢脾，蜂王产卵后记录日期，在工蜂即将羽化出房的前一天，将该封盖子脾脱蜂后带回实验室，放入34恒温培养箱中。次日新蜂出房后，用无毒、无味的油漆在胸背部标记约200头，迅即放回原蜂群中，之后于第315日期间随机从巢内捉取被标记的工蜂共80头，作为内勤蜂样本。随机从蜂箱前捉取足部携带花粉团的工蜂80头作为采集蜂样本。每次采样，将采得的蜜蜂在活体状态下用眼科镊分别取其触角、头、胸、腹和足，迅速投入液氮中研磨至粉状，置于80冰箱保存，该样本用于eal-timePC和Westernblot。冰冻切片及免疫组织化学定位检测用样本为实验当日于巢门前随机捉取采粉归巢的工蜂。12主要试剂总NA提取试剂Trizol、T-PC试剂盒PrimeScriptTMTeagentKit、荧光定量试剂盒SYBPrimeScriptTMT-PCKit等购自TaKaa公司;蛋白抽提液、BCA蛋白质定量试剂盒、蛋白上样缓冲液、超敏ECL化学发光底物、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒以及4%多聚甲醛固定液购自博士德生物有限公司;荧光定量用引物由华大科技服务有限公司合成;包埋剂为日本Sakura公司产品。13总NA的提取及cDNA合成根据Trizol试剂讲明书，提取内勤蜂和采集蜂各组织样本的总NA。采用微量核酸蛋白检测仪检测其浓度符合要求(OD值在1821之间)后，按T-PC试剂盒讲明书进行反转录合成第一链cDNA，作为PC以及荧光定量PC分析的模板。14荧光定量PC根据本课题组前期实验得到的中华蜜蜂OrcocDNA全序列设计特异性引物(表1)，对该基因在中蜂内勤蜂和采集蜂不同组织中的mNA表达水平进行荧光定量分析。eal-timePC反响总体系为20L，其中cDNA模版2L，SYBPremixExTaqTM(2×)10L，上、下游引物(10mol/L)各08L，OXeferenceDye(50×)04L，ddH2O6L。荧光定量的反响条件为:95预变性30s;循环条件955s，6330s，共40个循环。每个样本进行3次技术重复。以各样品所对应的ps18的Ct值为阳性对照，进而得到AcerOrco基因在内勤蜂和采集蜂各组织的表达谱。15多克隆抗体的制备以中华蜜蜂OrcocDNA全序列设计并合成多肽抗原，免疫2只健康的新西兰大白兔，之后采用G蛋白纯化和免疫亲和纯化2种方法进行抗体纯化。该部分实验委托京天成生物技术(北京)有限公司完成。16总蛋白的提取及Westernblot蛋白检测根据抽提液试剂盒讲明书，提取内勤蜂和采集蜂各组织样品的总蛋白。用BCA蛋白质定量试剂检测总蛋白浓度，10%SDS溶液调整各样品总蛋白浓度一致。将浓度调整后的各组织总蛋白一样体积加样到10%SDS-PAGE中进行电泳检测。分离后的蛋白转印70min到NC膜，脱脂奶粉封闭2h，TBST洗膜3次后，参加多克隆抗体，室温摇床孵育1h后，4孵育过夜。TBST洗膜3次后，参加羊抗兔IgG-HP二抗，室温孵育15h。充分洗膜后，用超敏ECL化学发光底物进行结果检测。17冰冻切片及免疫组织化学定位检测采集回巢时后足携带花粉的工蜂，活体将触角取下，在冰冻切片机中进行切片，厚度约5m。粘片后用4%的多聚甲醛溶液固定30min，蒸馏水洗3次，每次10min。之后，于30%H2O2与纯甲醇以150(v/v)的混合液中，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗2次。在载玻片上粘有组织的位置滴加5%BSA封闭液，室温放置4060min，弃去多余的液体，滴加稀释好的一抗，4孵育过夜，同时用PBS溶液代替一抗作为阴性对照。PBS洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37孵育30min。PBS再洗3次，滴加SABC，37孵育20min，PBS洗4次，每次10min。使用DAB显色剂进行显色，蒸馏水洗涤后用中性树脂(二甲苯稀释)进行封片。光学显微镜下观察结果，用Image-ProPlus70软件分析并拍照。18数据分析荧光定量结果应用MXPro-MX3000P软件(Stratagene，美国)进行分析处理。根据标准曲线及荧光曲线的Ct值，采用2Ct法进行数据分析(Livaketal，2001)。采用SPSS170软件中的ANOVA法进行单因素方差分析，Duncan氏法进行显著性差异分析。所得结果均以平均数±标准误(mean±SE)表示，并利用OriginPro80软件进行图形分析。21多克隆抗体检测结果AcerOrco多克隆抗体由京天成生物技术(北京)有限公司合成后，在实验室对抗体进行质量检测，选取的实验材料为中蜂胸部组织。结果如图1所示。从图1中能够看出，阳性结果在目的蛋白分子量处条带明晰，无杂带，阴性结果的相应位置无明显条带，讲明所制备的抗体确为目的蛋白抗体，且特异性较好。22AcerOrcomNA在中蜂内勤蜂和采集蜂不同组织的表达谱分析如图2所示，AcerOrco的转录本在内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，在采集蜂各组织中的表达量普遍高于内勤蜂的表达量(足部除外)(差异显著性用双星号表示)，且两者在触角中的表达量均高于其他组织1000倍以上，差异极显著(差异显著性用大写英文字母表示)。除触角外，在内勤蜂各组织中，足部的表达量相对较高，其次为头部和腹部，胸部的表达量最少;而在采集蜂各组织中，头部和胸部的表达量相对较高，且两组织中的表达量几乎无差异，其次为腹部，而足中的表达最少。23AcerOrco受体蛋白在中蜂各组织的表达分析AcerOrco在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白表达的Westernblot结果如图3所示，AcerOrco在内勤蜂和采集蜂的触角、头、胸、腹和足各组织中均有表达。其中，在内勤蜂头部中表达量最高，触角中次之，其他3个组织中表达量差异不大;采集蜂触角中表达量比头部高，胸、腹和足中的表达量较少。24AcerOrco在中蜂触角中的表达定位本实验用前期制备的多克隆抗体，与中蜂触角切片进行免疫组织化学反响，采用蓝色DAB染色，阳性结果为蓝色点状或圆盘状，背景为淡蓝色。对照组背景为无色或淡蓝色，无明显表达结果，讲明实验结果特异性较好。免疫组化结果显示，AcerOrco在中蜂触角鞭节中均有表达，且表达位置为感器神经元细胞层。AcerOrco在采集蜂触角中的表达结果既有点状(图4中黑色箭头所指)，又有圆盘状(图4中红色箭头所指)，点状表达结果相对较多一些，揣测AcerOrco在采集蜂触角的板形感器和毛形感器中均有表达，但毛形感器中的表达更多一些;在内勤蜂的触角中，主要为点状表达结果，圆盘状结果较不明显，揣测AcerOrco主要在内勤蜂触角上的毛形感器中表达。从图4中还能够看出，采集蜂触角中的点状表达结果明显多于内勤蜂，意味着采集蜂AcerOrco表达量高于内勤蜂。蜜蜂是一种营高度社会性生活的昆虫，在一个蜂群里，工蜂承当了除产卵之外的蜂巢内外的一切工作，内勤蜂是蜂群中的幼、青年工蜂个体，主要从事保温、扇风、饲喂幼虫和蜂王、清理巢房、夯实花粉、酿蜜以及筑巢等工作;采集蜂是蜂群中的壮年蜂，主要承当着外出采集花蜜、花粉、水和树脂等工作(Beshersetal，2001)，因而采集蜂接触到的气味分子的种类和数量更多。触角是昆虫的主要嗅觉器官，上面分布有大量的嗅觉感器，而气味受体基因主要在嗅觉感器的神经元细胞中表达(Vosshalletal，2000)。蜜蜂触角上分布有多种由皮细胞特化而来的化学感受器，其中，板形感器和毛形感器是最常见的2种感受器，这2种感受器皆与蜜蜂的嗅觉感受相关(Neuhausetal，2005;Nakagawaetal，2005)。本研究结果显示，AcerOrco在内勤蜂和采集蜂触角中的表达量均高于其他组织。AcerOrco在采集蜂中的表达量普遍高于内勤蜂(足除外)，这与内勤蜂和采集蜂在群内所承当的工作有关，也与张林雅等(2012)的研究结果相一致。AcerOrco在中蜂内勤蜂和采集蜂各组织中均有表达，且两者在触角中的表达量均极显著地高于其他组织，如内勤蜂触角中的表达量是头部的1600倍，胸部的3500倍，这使得头部、胸部和腹部的表达量几乎能够忽略不计，这与张林雅等(2012)报道的Orco在内勤蜂各组织中只在触角和足中表达，而在采集蜂各组织中均有表达的结论类似。在其他昆虫中对Orco表达特性的研究也有较多报道，如棉铃虫Heliothisarmigera、桃蛀螟Dichocrocispunctiferalis、斜纹夜蛾Spodopteralitura、中红侧沟茧蜂Microplitismediator、家蚕Bombyxmori等(Kriegeretal，2005;王桂荣等，2005;张帅等，2009a，2009b;杨承远，2010;陈茜等，2011;葛星等，2013)，其Orco基因或在触角中特异性表达，或在触角中表达量最高，与本研究结果基本相符，体现了Orco在不同昆虫间功能的保守性。目前对昆虫嗅觉受体蛋白表达特性的研究报道较少。本研究采用Westernblot技术对AcerOrco蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织的表达特性进行研究。结果显示，AcerOrco在采集蜂触角中表达最多，内勤蜂中头部表达量稍多于触角，这有可能是与实验中我们对触角蛋白溶液进行了浓缩，在此经过中产生了蛋白损耗有关。因而，总体上本实验结果与前期荧光定量的实验结果基本一致，这也从蛋白水平验证了Orco的表达特性。迄今对蜜蜂嗅觉受体基因的表达定位研究，大多采用原位杂交的方法，例如Krieger等(2003)采用原位杂交的方法对西方蜜蜂AmelOr2mNA的表达定位进行了研究，发现AmelOr2基因mNA主要在位于工蜂触角边缘的板形感器和毛形感器的细胞中表达。张林雅等(2012)利用免疫荧光技术对中华蜜蜂Orco受体进行亚细胞定位，发现该受体同样在毛形感器和板形感器中表达。而本课题组前期亦采用原位杂交技术对AcerOr2在中华蜜蜂触角上的表达进行了定位分析(Zhaoetal，2013;赵慧婷等，2015)，AcerOr2的阳性杂交信号出如今中蜂触角底膜边缘的一连串细胞中，而这些细胞恰恰处在毛形感器和板形感器中。本研究进一步采用免疫组化方法研究了AcerOr2蛋白表达特性，发现与原位杂交结果类似，AcerOrco在中蜂触角鞭节的毛形感器和板形感器中均有表达。其他昆虫的共受体基因，如DOr83b，AgOr7和MsexOr2等的表达情况也相类似(Foxetal，2001;Kriegeretal，2003;Malpeletal，2008;Patchetal，2009;Miuraetal，2010)。同时，本研究结果还显示，AcerOrco在采集蜂触角中的表达明显多于内勤蜂，这与mNA的表达结果相一致。目前多数有关Orco的功能研究均表明，Orco并不直接感受气味分子，需与传统气味受体Ors结合构成二聚体才能发挥嗅觉识别作用(Sakuraietal，2004)，故今后可结合详细的Ors共同进行功能研究，以进一步探索中蜂优越的蜜粉源搜索能力，为揭示中蜂的嗅觉识别机制提供一定的理论根据。