蒜片加工废水抑菌活性及稳定性.docx

蒜片加工废水抑菌活性及稳定性摘要：目的：进行大蒜废水抑菌活性和稳定性初步研究，为天然资源的开发利用提供理论根据，降低大蒜废水的污染。方法：利用微量稀释法对蒜片加工废水对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及耐药菌株的抑菌活性进行检测。结果：当培养基中含有2.5%3%浓度的大蒜废水时，能够明显抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和耐药菌株的生长；并且大蒜废水经过70处理或者常温放置5d后仍能保持抑菌活性。结论：大蒜废水能够代替抗生素作为家禽饲料的添加剂，抑制常见微生物菌株和一些具有耐药性菌株，避免家禽感染疾病，同时实现大蒜废水的资源利用，减少污染。大蒜(Garlic)又名胡蒜、葫，为百合科葱属植物1。是一种常见的、非常受欢迎的香料，且具有多种治疗作用2。最早在古埃及、古罗马和古希腊等地中海沿岸国家栽培。公元前100多年，大蒜由张骞从西域引入关中地区,后来逐步遍及全国。目前，中国已经成为全世界大蒜产量最高的国家3。大蒜已经成为人们日常生活的不可或缺的重要蔬菜类食物，在食品的加工经过中作为重要的辅助材料提升食物的风味。近年来，大蒜由于其良好的抗菌、消炎、炎、健胃、止咳、祛痰等功用而被深化研究，揭示了大蒜中含有大量的大蒜辣素(Allicin)而成为一种植物来源的天然抗菌剂4-7，展现出良好的保健作用。但在蒜片片加工经过中，要用水对切片机的刀片进行连续的冲洗，以确保切片机的正常运行，每年高达上千万t的蒜片加工废水因而而构成，而大蒜废水由于具有大蒜辣素而使得处理工序复杂，且易造成严重的环境污染，能否对大量的蒜片加工废水实现有效利用，避免废水中大蒜辣素的浪费，值得引起足够的重视。另外一方面，近年来，随着人们对养殖业持续低水平饲喂抗生素而造成的对人类健康的危害8-10，如细菌耐药、畜产品药物残留、过敏中毒反响以及“致畸致癌致突变作用等的等的认识的不断加深，越来越多的国家开场采取措施禁止在畜牧养殖产业中使用抗生素，假如大蒜废水能够表现出明显的抑菌活性，进而能够作为抗生素替代品用于养殖业。本研究中，以大蒜废水作为研究对象，就蒜片加工废水的抑菌活性进行了研究，同时也对蒜片加工废水作为抗生素替代品在热稳定性及存放时间的特性进行了研究。发现蒜片加工废水具有很好的抑菌作用，不仅能够抑制普通菌株，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，而且能够抑制耐药菌株，如金黄色葡萄球菌(ATCC43300，ATCC6538和CMCC(B)2600)和表皮葡萄球菌ATCC35764等，同时也对其大蒜辣素的含量进行了测定，为蒜片加工废水的资源化开发利用展现了很好的应用前景。1材料与方法1.1材料与仪器大蒜白皮蒜，山东金乡；胰蛋白胨英国oxoid公司；酵母提取物英国oxoid公司；氯化钠国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉国药集团化学试剂有限公司；L-半胱氨酸阿拉丁试剂上海有限公司；三羟甲基氨基甲烷西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；去离子水实验室制备。普通菌株：金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；枯草芽孢杆菌各1株均由江南大学药学院微生物实验室提供；耐药菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC43300，ATCC6538和CMCC(B)2600)及表皮葡萄球菌(ATCC35764)由无锡市疾病控制与预防中心提供)。SW-CJ-1FD干净工作台苏州安乐空气技术有限公司；BXM30R灭菌锅上海博迅实业有限公司；EppendorfResearchplus移液器艾本德中国有限公司；BPH-9052恒温培养箱冠森生物科技上海有限公司；DZF-6050数显鼓风枯燥箱林茂科技北京有限公司；申科R-201旋转蒸发器无锡市申科仪器厂；HHCJ-4C恒温水浴锅常州诺基仪器有限公司；SHB-A循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司；ZF-20A暗箱四用紫外分析仪上海骥辉科学分析仪器有限公司；T6系列紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；九阳切片机九阳股份有限公司。1.2实验方法1.2.1反响试剂配制Tris-HCl缓冲液pH7.5,50mmol/L：精细称取1.5000gTris三羟甲基氨基甲烷，适量去离子水溶解，调节pH7.5，转移至250mL容量瓶中并定容至刻度；半胱氨酸10mmol/L：精细称取0.0030gL-半胱氨酸，适量50mmol/LTris-HCl缓冲液pH7.5溶解，转移至50mL棕色容量瓶中，并定容至刻度；DTNB1.0mmol/L：精细称取0.0198gDTNB5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，适量50mmol/LTris-HCl缓冲液pH7.5溶解，转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。1.2.2大蒜废水制备称蒜瓣30g，去皮用切片机切片，将蒜片收集在烧杯中并用少量水将切片机冲洗干净。向烧杯中添加去离子水至60mL，然后置室温(20)下浸泡2h。四层纱布过滤，滤液置4冰箱避光保存，作为大蒜废水原液待用，并利用分光光度计方法11-12测定大蒜废水原液中大蒜辣素的含量。1.2.3菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及耐药菌株ATCC43300、ATCC6538、CMCC(B)2600和ATCC35764分别接种于营养琼脂斜面，37培养24h，然后分别用10mL生理盐水将各个斜面细胞洗下制成菌悬液，将菌悬液用无菌生理盐水稀释至106CFU/mL，备用。1.2.4大蒜废水对普通菌株的最小抑菌浓度的测定将大蒜废水原液用去离子水稀释成不同浓度的溶液，根据培养基:溶液=9:1(v/v)的配比配制含不同浓度大蒜废水的营养琼脂培养基，分别使得培养基中所含有的大蒜废水终浓度为0.5%4%，充分混匀，倒平板。待凝固后，用移液器汲取100L制备好的菌悬液均匀涂布于平板中，放入37恒温培养箱中培养24h，每个菌每个浓度重复3次13-14，以培养基:去离子水=9:1(v/v)的LB培养基为空白对照阴性对照，以含50g/mL卡那霉素的LB培养基为阳性对照。1.2.5大蒜废水对耐药菌株的抑菌活性的测定根据上述普通菌株的最小抑菌浓度的方法配制含大蒜废水的营养琼脂培养基，分别用移液器汲取制备好的耐药菌株ATCC43300，ATCC6538，CMCC(B)2600，ATCC35764菌悬液各100L均匀涂布于平板中，放入37恒温培养箱中培养24h，每个菌株重复3次，空白对照为培养基:去离子水=9:1(v/v)的LB培养基。1.2.6温度对大蒜废水抑菌效果的影响该将大蒜废水分成四份，分别置于4、37、70、90水浴中处理1h，然后按最小抑菌浓度测定方法配成含大蒜废水的营养琼脂培养基，涂布100L金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，观察经过不同温度处理后的大蒜废水能否抑制普通微生物的生长。1.2.7放置时间对大蒜废水抑菌效果的影响将大蒜废水原液在室温下放置1、3、5、7d后取出与培养基混合成含大蒜废水的营养琼脂培养基，涂布100L金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，观察放置不同天数后的大蒜废水能否保持抑菌活性。1.3数据统计分析1.3.1大蒜废水中大蒜辣素含量的测定取5mL10mmol/L半胱氨酸溶液，加1mL去离子水，摇匀后取1mL于100mL的容量瓶中，定容至刻度，取定容后的半胱氨酸溶液4.5mL与0.5mL的DTNB溶液，25保温15min，然后412nm波长测定半胱氨酸吸光值A0，按同样操作将去离子水替换为大蒜废水原液，测定半胱氨酸吸光值A。1.3.2温度对大蒜废水中大蒜辣素含量的影响取2mL大蒜废水原液4组，分别在4、37、70、90条件下处理60min，每处理10min后取出，按上述1.3.2中大蒜辣素含量的测定方法，以各温度下，大蒜辣素含量为纵坐标，处理时间为横坐标，作大蒜辣素含量温度关系图。1.3.3大蒜废水放置时间对大蒜辣素含量的影响将大蒜废水原液在室温下分别放置1、2、3、4、5、6、7d后测定大蒜废水中大蒜辣素的含量，大蒜辣素含量为纵坐标，放置时间为横坐标，作大蒜辣素含量放置时间关系图。2结果与分析2.1大蒜废水对普通菌株的最小抑菌浓度当LB培养基中大蒜废水的含量为0.5%1.2%及空白组条件下，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均能够正常生长，在高浓度大蒜废水以及卡那霉素的阳性条件下，微生物生长被抑制，讲明一定浓度的大蒜废水能够产生类似卡那霉素的抑菌效果图1和图2，其中大蒜废水在3.0%的浓度下，明显抑制了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长图2a和图2c，而大蒜废水对枯草芽孢杆菌的作用愈加明显，在浓度为2.5%时，能够抑制枯草芽孢杆菌的生长图2b。这讲明大蒜废水对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为3.0%V/V，而对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为2.5%，通过大蒜废水中大蒜辣素含量为529g/mL可知(表1)，大蒜废水中大蒜辣素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为15.87g/mL，而对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为13.23g/mL。在已有的文献报道中，大蒜辣素对革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度为1530g/mL，而对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度为510g/mL7，这与本研究中的实验结果接近，进一步表明，大蒜废水具有明显的抑菌效果正是由于含有大蒜辣素。2.2大蒜废水对耐药菌株的抑菌活性空白组以去离子水代替大蒜废水与琼脂配制成的培养基中的耐药菌株均能正常生长，而当培养基中含有3%V/V浓度的大蒜废水时，培养皿无可见菌落，表明对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度对耐药菌株同样具有抑菌活性，即大蒜废水含有15.87g/mL的大蒜辣素时，能够抑制耐药菌株的生长，在其对普通微生物菌株的最小抑菌浓度条件下对耐药菌株同样具有抑菌活性，在已有的数据表明，大部分菌株对大蒜辣素敏感，最小抑菌浓度为16g/mL，另外，当大蒜辣素作用于耐药甲氧西林与非耐药的表皮葡萄菌时，两种菌株的生长均遭到抑制7，这讲明大蒜废水中15.87g/mL的大蒜辣素足以表现出对耐药菌株的抑菌活性。2.3温度和放置时间对大蒜废水抑菌活性的影响2.3.1温度对大蒜废水抑菌活性的影响在90水浴处理的大蒜废水培养皿中出现了菌落的生长，讲明大蒜废水经90处理后，失去活性；而经过4、37、70水浴处理后的大蒜废水培养皿中没有出现菌落，讲明大蒜废水在4、37、70处理后没有完全丧失其抑菌活性，即大蒜废水能够在470温度下保持稳定14，同时，通过测定上述温度处理不同时间后，大蒜废水中大蒜辣素的含量，结果如图5所示，在90处理下，大蒜废水原液中大蒜辣素的含量下降较快，处理60min后，大蒜辣素的含量只要400g/mL，在3%大蒜废水的培养基缺乏以抑制微生物的生长，而在470温度条件下，大蒜辣素的含量下降缓慢，大蒜辣素含量仍然足以抑制微生物生长，从图5能够发现，温度越高，大蒜废水中大蒜辣素毁坏的速率越快15。大蒜废水中大蒜辣素在470具有良好的热稳定性，这一特性为今后大蒜废水开发成抗生素替代品提供了更多的可能性。2.3.2大蒜废水室温放置不同时间后抑菌活性的变化在室温条件下放置1、3、5d后的大蒜废水仍然能够保持良好的抑菌活性，而放置7d后，抑菌活性下降，培养皿中出现了普通菌株的生长，讲明在室温条件下，大蒜废水能够持续较长时间抑制普通菌株的生长，通过测定放置不同时间后大蒜废水原液中大蒜辣素的含量发现，放置5d后，大蒜废水中的大蒜辣素含量仍保持在80%以上，这与已有的研究结果相吻合16，同时随着放置时间的增加，大蒜辣素的下降越来越快，放置6d后，大蒜辣素含量缺乏以抑制微生物生长。在已有的研究结果中，大蒜辣素避光保存后至35d后仍能够保持抑菌活性14，相比已有文献，本实验中大蒜废水中大蒜辣素存放时间大大缩短，可能是由于水溶液中大蒜辣素不够稳定15，在后期的开发中，能够选择适宜的有机溶剂以低温条件下保存大蒜辣素17-18。综上所述，大蒜废水由于含有大蒜辣素而具有良好的抑菌活性，能够同时抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，并且确定3%为大蒜废水的最小抑菌浓度对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为2.5%，进一步发现3%浓度的大蒜废水能够明显地抑制耐药菌株的生长。通过对大蒜废水高温处理、室温放置不同时间等一系列实验，讲明该大蒜废水在70温度处理下具有较好的热稳定，同时其能够在水溶液、室温条件下存放56d而保持明显抑菌活性。大蒜废水中具有大蒜辣素而表现出明显的抑菌活性，并且在较低的浓度时，便能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长，显现出大蒜废水替代抗生素的宏大潜力，同时对耐药菌株的作用为大蒜废水将来的临床研究奠定基础，大蒜废水的合理利用，能够有效地解决大蒜废水环境污染这一亟待解决的问题。